孫敏紅 ，謝深喜 ，盧曉鵬 ，李 靜

（1.中南林業(yè)科技大學 林學院，湖南 長沙 410004；2.湖南農業(yè)大學 園藝園林學院，湖南 長沙 410128）

枳Poncirus trifoliate（L）.Raf是我國大部分柑橘產區(qū)常用的砧木類型，具有耐寒、耐旱、耐瘠，抗流膠病、裙腐病、線蟲病等優(yōu)點，嫁接植株也具有矮化、早期豐產、果實品質優(yōu)良等特性。柑橘生產中經常發(fā)生氮肥過量但吸收利用較少的現象。硝態(tài)氮是進入植物體的主要氮素形態(tài)之一，植株中硝態(tài)氮累積是旱作植物的共性[1]。除作為營養(yǎng)物質外，硝態(tài)氮還可以作為植物體各種代謝過程的信號物質及滲透調節(jié)物質。根據作物體內的硝態(tài)氮含量，調控氮肥用量以控制作物生長發(fā)育，可保證作物高產，且降低作物體內過量累積硝態(tài)氮，避免養(yǎng)分資源的浪費。

硝酸還原酶（NR）是硝酸鹽還原過程的關鍵酶和限速酶，其活性反映出植物對硝態(tài)氮的還原及轉化能力，并與植物吸收和積累硝態(tài)氮的能力密切相關[2]。該酶是一種水溶性鉬黃蛋白，為同聚多亞基蛋白，每個亞基含有3個輔基：黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）、細胞色素（Cytc）以及鉬輔因子（MoCo），每個輔基就是一個氧化還原中心[3]。鉬原子（Mo）作為酶的重要組成部分，參與硝態(tài)氮還原為銨的過程[4]。而鎢酸鈉（Na2WO4）中的鎢原子（W）性質與鉬原子相似，可以直接取代硝酸還原酶復合體中的鉬，從而起到抑制酶活性的作用[5]。

為提高柑橘植株氮利用效率，筆者以柑橘主要砧木類型枳為材料，研究不同濃度鎢酸鈉溶液處理后枳幼苗生物量及硝態(tài)氮含量的變化，篩選最佳的處理濃度及處理時間，旨在為柑橘生產中氮肥過量后的緩解探索可行方法，為柑橘生產中氮肥施用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為1年生枳實生幼苗，采用沙培方法培養(yǎng)，取1年生長勢基本一致的枳幼苗，種于沙子與珍珠巖1∶1混合的基質中。移栽初期用水澆灌，使其適應，1個月后進行處理。整個培養(yǎng)過程在湖南農業(yè)大學柑橘中心溫室里進行。

1.2 測定項目與方法

1.2.1 試驗處理

以Hoagland營養(yǎng)液為基本配方，處理溶液分別為0.5，1.0，1.5，2.0 mmol/L鎢酸鈉溶液。對照采用Hoagland營養(yǎng)液澆灌，2天1次。不同處理用鎢酸鈉溶液與Hoagland營養(yǎng)液輪流澆灌。處理后，每隔7 d取樣1次，共取樣6次，用于生長量及硝態(tài)氮含量的測定。

1.2.2 樣品干質量的測定

每次取樣后，分別稱量幼苗根、莖、葉的質量。并放于80 ℃下烘箱中烘干72 h，取出后再次稱其質量，即為干質量，以“g”為單位。每個處理3次重復，每次重復取3株幼苗。

1.2.3 硝態(tài)氮含量的測定

將烘干樣品打碎成粉末狀，用于測定硝態(tài)氮含量。測定方法為：取干樣0.5 g，經過硫酸-過氧化氫消煮后得到透明消煮液[6-8]。取5 mL消煮液于50 mL比色管中，無氨水稀釋并定容，搖勻后在波長210 nm處用紫外分光光度計進行硝態(tài)氮含量的測定。以無氨水為參比，測其吸光度，然后根據標準曲線計算其硝態(tài)氮含量。

其中，Fm為NO－3-N的質量分數；C為樣品液NO－3質量濃度；N為稀釋倍數；m為樣品干質量。

1.2.4 硝態(tài)氮標準曲線的制作

分別吸取含硝態(tài)氮的標準液[9]0，1，2，3，4，5，6 mL于50 mL比色管中，各加1 mL空白消煮液，用水稀釋至50 mL，搖勻，測定OD210后繪制標準曲線。其線性關系較好，回歸方程為：y＝0.618x＋0.035，相關系數R2＝0.997（n＝7）。

1.2.5 數據分析

利用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行方差分析。采用LSD法對不同處理結果進行顯著性比較。

2 結果與分析

2.1 不同鎢酸鈉處理對枳幼苗生長量的影響

不同鎢酸鈉溶液處理對枳幼苗根莖葉生長量的影響見表1。由表1可知，不同濃度鎢酸鈉處理對枳幼苗根、莖、葉干質量變化有一定影響，處理42 d后，所有處理中各部位的干質量均顯著低于對照，其中處理2（1.0 mmol/L鎢酸鈉溶液）中不同部位的干質量均顯著高于其它處理，但仍低于對照。

各處理間葉片干質量均有顯著差異，各處理按照葉片干質量由高到低排序依次為對照、處理2、處理3、處理1、處理4。對照的莖干質量顯著高于其它處理，處理2顯著高于處理1、3和4；處理1和處理3之間無顯著差異但均顯著高于處理4。不同處理間根系干質量差異顯著，各處理按照根系干質量由高到低排序依次為對照、處理2、處理3、處理1、處理4，這與葉片干質量變化表現一致。

表1 不同鎢酸鈉處理對枳不同部位干質量的影響?Table 1 Effect of different NaWO4 treatments on dry mass of different organs in Poncirus trifoliate seedlings g

2.1.1 不同鎢酸鈉處理對枳幼苗葉片干質量變化的影響

葉片是光合作用器官，是果實產量形成的重要因素，故可通過葉片干質量含量的變化篩選出鎢酸鈉處理的最佳濃度和處理時間。

不同濃度鎢酸鈉溶液處理對枳葉片干質量的影響動態(tài)見圖1。由圖1可以看出，對照葉片干質量是隨著時間增加而逐步增加，而各處理中葉片干質量均表現為先升高后降低的趨勢。處理1隨著時間增加表現出葉片干質量先增加后減少，處理28 d后植株有新葉抽生，且生物量增加到最大（1.03 g），但仍顯著低于處理2和對照，隨后生物量開始減少；處理2培養(yǎng)28 d后，生物量達到最大（1.72 g），且顯著高于其它處理及對照，試驗中觀察植株有新葉抽生，并有分枝；處理3培養(yǎng)21 d后，葉片干質量達到最大（0.81 g），低于其它處理而顯著高于處理4的葉片干質量，隨后葉片干質量逐漸減少，并表現出植株矮小，葉片黃化、稀少等癥狀；處理4培養(yǎng)28 d時，葉片生物量達到最大（0.67 g），但顯著低于其它處理及對照，之后葉片干質量逐漸降低，生長表現為植株細小，42 d時植株下部葉片已完全脫落，葉片平均干質量僅為0.1 g，這可能與氮素含量減少有關。由葉片的干物質含量可看出最適的鎢酸鈉處理濃度為1.0 mmol/L，處理時間為28 d，隨著處理時間延長，葉片干質量會下降。

圖1 鎢酸鈉處理對枳葉片干質量的動態(tài)影響Fig.1 Dynamic effect of NaWO4 treatments on dry mass of Poncirus trifoliate leaf

圖2 鎢酸鈉處理對枳莖干質量的動態(tài)影響Fig.2 Dynamic effect of NaWO4 treatments on dry mass of Poncirus trifoliate stem

2.1.2 不同鎢酸鈉處理對枳幼苗莖干質量變化的影響

莖干的干質量可反映出植物的大小及健壯程度，不同濃度鎢酸鈉溶液處理對枳幼苗莖干質量的影響動態(tài)見圖2。

由圖2可知，對照枳幼苗莖的干質量逐步增加，而鎢酸鈉處理表現為先增加后降低的趨勢。其中，對照隨著時間延長，莖干質量急劇增加，42 d時已由最初的1.02 g增加至3.55 g；處理1中培養(yǎng)28 d后莖干質量增加至最大（2.48 g），顯著低于處理2卻高于其它處理，之后莖干質量逐漸降低；處理2培養(yǎng)28 d后莖干質量達到最大（3.16 g），隨后逐漸降低，且第2～7次取樣所測的莖干質量均顯著高于其它處理及對照，植株莖桿較粗；處理3培養(yǎng)21 d后莖干質量達到最大（2.25 g），顯著低于處理2但高于其它處理及對照，后逐漸降低；處理4培養(yǎng)28 d后莖干質量達到最大（2.0 g），但仍顯著低于其它處理和對照的莖干質量，之后開始大幅度降低，所測植株莖干細長。由此可知，低濃度的鎢酸鈉溶液對莖干生長有一定的促進作用，而高濃度（2.0 mmol/L）的鎢酸鈉對植物的莖干生長有抑制作用。由莖干質量的變化可以看出，鎢酸鈉最佳濃度為1.0 mmol/L，處理時間為28 d時莖干生長健壯，處理時間延長后生長勢減弱。

2.1.3 不同鎢酸鈉處理對枳幼苗根系干質量變化的影響

根系是植物吸收養(yǎng)分的主要器官，只有健壯的根系才可以吸收更多的營養(yǎng)，根系干質量可反映出植株根系的發(fā)達程度。不同濃度鎢酸鈉溶液處理對枳幼苗根干質量的影響動態(tài)見圖3。

圖3 鎢酸鈉處理對枳根系干質量的動態(tài)影響Fig.3 Dynamic effect of NaWO4 treatments on dry mass of Poncirus trifoliate root system

由圖3可知，對照處理隨著培養(yǎng)時間增加根系干質量逐漸增加，其它處理則表現為先增加后降低的趨勢；其中對照處理的根系干質量由第1次取樣的0.39 g增加至第6次取樣的1.36 g，根系形態(tài)表現為根系發(fā)達，須根多；處理1栽培28 d時根系干質量達到最大值1.18 g，顯著低于處理2卻高于其它處理和對照，隨后根系干質量緩慢降低；處理2在培養(yǎng)28 d時根系干質量達到最大值1.70 g，顯著高于其它處理及對照，之后開始降低；處理3根系干質量由第1次取樣時的0.3 g增至第4次取樣時的1.0 g，但顯著低于處理1和處理2，但高于處理4和對照，隨后根系干質量緩慢下降；處理4的根系增重緩慢，且顯著低于其它處理及對照，之后根系干質量逐步下降，形態(tài)表現為根系稀少，老化。根據不同鎢酸鈉處理植株根系干質量的變化可知，1.0 mmol/L鎢酸鈉溶液處理28 d時對枳幼苗根系生長有促進作用，隨著處理時間延長根系干質量逐步下降。

通過根、莖、葉干質量的變化趨勢可以看出，鎢酸鈉溶液處理初期對植物生長有一定的促進作用，這可能是因為一定濃度的Na+對植物生長的促進；但隨著處理時間延長，植物各個部位干質量表現為下降趨勢，可能是過量Na+的毒害或鎢酸鈉溶液處理引起局部氮素含量變化所導致。

2.2 不同鎢酸鈉處理對枳幼苗硝態(tài)氮含量變化的影響

處理42 d后，不同鎢酸鈉溶液對枳幼苗根、莖和葉中硝態(tài)氮含量的影響見表2。由表2可知，葉片硝態(tài)氮含量表現為隨著鎢酸鈉濃度的增加，所有處理的葉片硝態(tài)氮含量均顯著少于對照，但處理間硝態(tài)氮含量差異不顯著；幼苗莖部硝態(tài)氮含量隨著鎢酸鈉溶液濃度增加而減少，其中處理4的硝態(tài)氮含量顯著低于其它處理，處理2與處理3無顯著差異，處理1與對照的莖干硝態(tài)氮含量無顯著差異，但顯著大于其它處理；不同鎢酸鈉濃度處理的根系硝態(tài)氮含量表現為所有處理均顯著高于對照，其中處理4硝態(tài)氮含量最高為0.26，其它處理間無顯著差異。由此可知，一定濃度的鎢酸鈉處理可以降低葉片和莖干的硝態(tài)氮含量，而根的硝態(tài)氮含量有所增加，這與楊榮等在油菜上的研究結果相一致[10]。

2.2.1 不同鎢酸鈉處理對枳葉片硝態(tài)氮含量變化的影響

葉片中大部分氮以硝態(tài)氮形式存在，而葉片硝態(tài)氮含量直接反映出植物體內硝態(tài)氮累積和代謝狀況，故硝態(tài)氮是植物氮素營養(yǎng)、氮素同化利用與再利用狀況的重要指標。不同鎢酸鈉處理對枳幼苗葉片中硝態(tài)氮含量的影響進程見圖4。由圖4可知，隨著處理時間的延長，所有處理的葉片硝態(tài)氮含量均有所下降。其中對照的硝態(tài)氮含量由第1次取樣時的0.38 mg/g降至第6次取樣時的0.14 mg/g，顯著大于其它處理；鎢酸鈉溶液處理的植株硝態(tài)氮含量隨處理時間延長也有所下降，處理42 d后不同處理間硝態(tài)氮含量無顯著差異，但顯著低于對照。由此可以看出，鎢酸鈉溶液處理對降低葉片硝態(tài)氮含量具有顯著效果，但不同濃度處理間差異不顯著。

表2 鎢酸鈉處理對枳不同部位硝態(tài)氮含量的影響Table 2 Effect of NaWO4 treatments on nitrate nitrogen content in different organs of Poncirus trifoliate mg·g-1

圖4 鎢酸鈉處理對枳葉片硝態(tài)氮含量的動態(tài)影響Fig.4 Dynamic effect of NaWO4 treatments on nitrate nitrogen content in Poncirus trifoliate leaf

2.2.2 不同鎢酸鈉處理對枳莖硝態(tài)氮含量變化的影響

不同鎢酸鈉濃度處理對枳幼苗莖的硝態(tài)氮含量的影響進程見圖5。由圖5可知，隨著處理時間增加，對照幼苗莖部硝態(tài)氮含量逐步下降，由第1次測定時的0.29 mg/g降到處理42 d后的0.2 mg/g；而被處理植株的硝態(tài)氮含量均出現先增加后下降的趨勢；處理1前4次所測定硝態(tài)氮含量變化不明顯，處理28 d后硝態(tài)氮含量迅速下降；處理2前期硝態(tài)氮含量緩慢增加，由最初的0.27 mg/g增加到最大值0.31 mg/g，培養(yǎng)14 d后開始迅速下降；處理3與處理4莖硝態(tài)氮含量表現為前期無明顯變化，培養(yǎng)21 d后開始迅速下降。處理42 d后，處理2、處理3和處理4的硝態(tài)氮含量顯著低于處理1和對照。

圖5 不同鎢酸鈉處理對枳莖硝態(tài)氮含量的動態(tài)影響Fig.5 Dynamic effect of NaWO4 treatments on nitrate nitrogen content in Poncirus trifoliate stem

2.2.3 不同鎢酸鈉處理對枳根系硝態(tài)氮含量變化的影響

不同鎢酸鈉處理對枳根系硝態(tài)氮肥含量變化的影響如圖6所示。由圖6可知，隨著培養(yǎng)時間增加，對照根系硝態(tài)氮含量逐漸減少，由第1次測定時的0.24 mg/g降至第6次取樣時的0.13 mg/g。這說明正常管理的植株根系硝酸還原酶活性較高，可將根系吸收的硝態(tài)氮運轉至地上部，減少根系硝態(tài)氮積累；處理1與處理2、處理3均表現為硝態(tài)氮含量先降低后增加，這可能是因為低濃度的鎢酸鈉溶液短期處理對幼苗根系硝酸還原酶活性影響不大，但處理一定時間后硝態(tài)氮含量開始緩慢增加，可以看出這3個處理均在培養(yǎng)14 d后開始抑制硝酸還原酶活性，減少了硝態(tài)氮的轉運，致使硝態(tài)氮積累；而處理4培養(yǎng)初期硝態(tài)氮含量無顯著變化，后期開始逐步積累，這可能是因為高濃度鎢酸鈉溶液對硝酸還原酶活性的抑制作用較強，故短期內使得硝態(tài)氮無轉運，且逐步積累。在培養(yǎng)42 d后，所有處理中表現為隨著鎢酸鈉溶液濃度增加，硝態(tài)氮含量也增加，處理4硝態(tài)氮含量顯著高于其它處理，而處理1硝態(tài)氮含量最低，其它處理間無顯著差異。

圖6 不同鎢酸鈉處理對枳根系硝態(tài)氮含量的動態(tài)影響Fig.6 Dynamic effect of NaWO4 treatments on nitrate nitrogen content in Poncirus trifoliate root system

通過枳幼苗根、莖和葉硝態(tài)氮含量變化可以看出，鎢酸鈉處理對莖和葉硝態(tài)氮含量有顯著降低作用，且濃度越大，硝態(tài)氮含量下降越明顯，但導致根系硝態(tài)氮積累，隨著濃度越大，根系硝態(tài)氮含量越多，高濃度的鎢酸鈉溶液雖然可顯著降低莖和葉片中硝態(tài)氮的含量，但植物生長受到一定影響。結合植物生長狀況及各部位干質量變化，確定最佳鎢酸鈉濃度為1.0 mmol/L，處理時間為28 d。

3 結論與討論

不同植物的硝酸還原酶活性對鎢酸鈉的響應不同, 即達到抑制效果所需的濃度不盡相同。水稻根系應用的最佳鎢酸鈉濃度為0.15 mmol/L[11]，小白菜應用的最佳濃度是0.8 mmol/L[12]，而油菜應用的最佳濃度是1.0 mmol/L[10]。本研究中枳幼苗各個部位生長狀況及干質量變化和不同部位的硝態(tài)氮含量變化表明，鎢酸鈉對枳各個部位硝酸還原酶活性同樣有顯著的抑制作用，以1.0 mmol/L濃度，處理28 d為宜，此時對植物生長無明顯影響且有效降低莖與葉的硝態(tài)氮含量，說明枳對于鎢酸鈉對硝酸還原酶結構的抑制不如水稻、小白菜等草本植物敏感，但當濃度增加到一定程度，處理一定時間后同樣可以達到較好的抑制效果。

有研究表明，植物根系內硝酸還原酶活性被抑制后會造成根系硝態(tài)氮的大量積累[13-15]。本試驗中，一定濃度鎢酸鈉處理下，根系中有積累的硝態(tài)氮，但莖葉中硝態(tài)氮含量未增加，說明根系硝酸還原酶活性受抑制后，根系中積累的硝態(tài)氮并沒有被運輸到地上部分。這可能是植物對硝態(tài)氮的吸收和向上運輸是主動運輸過程，需提供能量所致[16]；也可能是因為植物根系硝酸還原酶活性被抑制后，硝態(tài)氮的還原無法正常進行，則氮代謝下游的氨基酸無法產生，所以阻礙下游信號的傳遞，使植株無法對氮素進行正常的分配和轉移[17]。而根系中硝態(tài)氮的過度積累導致根系弱化，吸收能力顯著下降，可以有效減少對氮肥的攝入。

外源鎢酸鈉在一定濃度水平處理下降低植株體內NO3－含量可能是由于NO3－由陰離子通道進入液泡遭受到WO42－的競爭性抑制；而WO42－在一定濃度范圍內可替代NO3－向細胞質轉移，從而提高作物的氮素同化；而隨著外源鎢酸鈉溶液水平的增加，逐漸構成較強的滲透脅迫，使硝酸鹽同化受阻，因而表現根系細胞中硝酸鹽含量上升的現象；同時葉片中硝酸鹽含量下降，植株生長受到顯著抑制。故在柑橘生產中氮肥過量時，可配施含一定濃度鎢酸鈉的肥料，降低植株體內硝酸鹽含量，從而提高氮素利用效率，同時改善作物品質。而這個推測的各個過程及機制還需進一步研究和驗證。

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