焦保華，梁朝輝，王苑宇，孫實(shí)安，席增輝

（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科，河北石家莊050000）

人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本庫的初步建立與管理

焦保華，梁朝輝，王苑宇，孫實(shí)安，席增輝

（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科，河北石家莊050000）

目的建立腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本庫，充分保護(hù)和合理應(yīng)用膠質(zhì)瘤標(biāo)本，為膠質(zhì)瘤的臨床及科研提供腫瘤標(biāo)本。方法收集腦膠質(zhì)瘤患者手術(shù)前靜脈血、獲取新鮮腫瘤組織標(biāo)本和部分正常腦組織標(biāo)本，分別提取血液及組織標(biāo)本中DNA、RNA以及蛋白，貯存于－196℃液氮罐中，記錄每例患者流行病學(xué)特點(diǎn)及病理診斷，術(shù)后6個(gè)月開始進(jìn)行隨訪。結(jié)果全血及組織中提取的基因組DNA、組織標(biāo)本中提取的總RNA其OD260/280比值都在1.8～2.1之間、所提取蛋白經(jīng)二辛可酸法蛋白定量檢測均能夠滿足膠質(zhì)瘤分子生物學(xué)研究的需要。結(jié)論腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本庫的初步建立，形成了一套系統(tǒng)的、可行的膠質(zhì)瘤標(biāo)本庫的建設(shè)及管理方法，可為膠質(zhì)瘤的分子生物學(xué)研究提供標(biāo)本和相關(guān)資料來源。

神經(jīng)膠質(zhì)瘤；生物標(biāo)本庫；組織和管理

腦膠質(zhì)瘤是嚴(yán)重危及人類生命的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率占顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的44.7％［1］。徹底認(rèn)識膠質(zhì)瘤分子生物學(xué)特性、有效的治療膠質(zhì)瘤、防止膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)是當(dāng)今膠質(zhì)瘤研究領(lǐng)域中亟待解決的難題。收集足夠數(shù)量的膠質(zhì)瘤標(biāo)本是成功開展膠質(zhì)瘤實(shí)驗(yàn)研究工作的基本條件之一，建立膠質(zhì)瘤標(biāo)本庫已引起全世界神經(jīng)膠質(zhì)瘤研究治療中心的廣泛重視。

1 資料與方法

1.1 主要設(shè)備：TAYLOR-WHARTON低溫罐（美國），櫻花全自動組織包埋機(jī)（日本），RM2135型切片機(jī)（德國LEICA公司），CS-VI型攤片烤片機(jī)（孝感宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司），離心機(jī)LXJ-64-01（北京），eppendorf核酸蛋白定量測定儀（德國eppendorf公司），全自動酶標(biāo)分析儀（美國，Invitrogen公司）。

1.2 主要試劑：Trizol（美國Invitrogen公司），蛋白酶K（德國），亞硫酸氫鹽（美國Sigma），對苯二酚（美國Sigma），Wizard DNA純化試劑盒（美國，promega），蛋白裂解液RIPA、PMSF（北京博奧森公司），二辛可酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒（武漢博士德）。

1.3 血液標(biāo)本的收集、處理及保存：選擇擬進(jìn)行手術(shù)切除治療的腦膠質(zhì)瘤患者，簽署知情同意書，抽取靜脈血10mL，其中5mL應(yīng)用Wizard DNA純化試劑盒提取血液基因組DNA，放入－4℃冰箱凍存?zhèn)溆?。?mL血液靜置2～3h后，使用3000r/min離心機(jī)離心10min，吸取血清后分裝到標(biāo)記好的凍存管內(nèi)進(jìn)行液氮凍存。

1.4 膠質(zhì)瘤標(biāo)本的收集、處理及保存：選擇擬進(jìn)行手術(shù)切除治療的膠質(zhì)瘤患者，簽署知情同意書，標(biāo)本在手術(shù)過程中獲取，正常腦組織來自于大腦半球非功能區(qū)的瘤周正常腦組織，腫瘤組織與正常腦組織的辨認(rèn)至少由2名神經(jīng)病理科醫(yī)師進(jìn)行診斷，在保證醫(yī)院病理科留取有足夠用于診斷的標(biāo)本后，分別將所獲組織切成數(shù)塊，一部分標(biāo)本放入已貼好患者信息的無菌凍存管中，立即投入便攜式液氮瓶中，之后轉(zhuǎn)存入實(shí)驗(yàn)室液氮罐中進(jìn)行保存，用于組織RNA、DNA、總蛋白的提?。涣硪徊糠謽?biāo)本放入10％甲醛固定，擇期石蠟包埋進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測。

1.5 標(biāo)本RNA、DNA及蛋白的提?。簩ρ汉徒M織基因組DNA的提取按照試劑操作說明書的流程進(jìn)行操作，按照組織RNA、DNA及蛋白提取裂解流程，提取組織RNA、DNA及總蛋白。

1.6 術(shù)后患者隨訪：對納入標(biāo)本庫的患者，在手術(shù)后6個(gè)月開始進(jìn)行隨訪調(diào)查。調(diào)查內(nèi)容包括術(shù)后的放療和化療情況，以及患者的生存期。目前隨訪正在進(jìn)行中。

1.7 數(shù)據(jù)庫的建立與管理：自行設(shè)計(jì)開發(fā)出一套信息管理系統(tǒng)應(yīng)用于標(biāo)本庫的管理，由專人負(fù)責(zé)標(biāo)本收集、保存及其使用。信息管理系統(tǒng)主要內(nèi)容如下。①患者信息錄入，包括患者的姓名、性別、年齡、職業(yè)、住院號、病理號、臨床診斷、病理診斷、病程和病期、隨訪聯(lián)系方式等。②標(biāo)本存放位置信息，包括入庫日期、編號、標(biāo)本數(shù)量、存放位置坐標(biāo)等。③標(biāo)本使用管理，包括使用人、出庫日期、標(biāo)本原始位置、審批人、經(jīng)手人等。④留取患者影像學(xué)資料。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)本收集情況：完成了標(biāo)本庫信息數(shù)據(jù)管理軟件的開發(fā)工作，并將該信息管理軟件系統(tǒng)應(yīng)用于腫瘤標(biāo)本庫的管理，對所收集患者的臨床特征、標(biāo)本數(shù)量、標(biāo)本存放位置等信息按上述數(shù)據(jù)庫的管理要求錄入計(jì)算機(jī)歸檔管理。截至2011年10月1日共收集新鮮腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本113例，正常對照腦組織31例。已經(jīng)提取獲得不同級別腦膠質(zhì)瘤全血DNA 67例，制作組織蠟塊93例，提取組織DNA及RNA 79例及腫瘤總蛋白質(zhì)73例。

2.2 腫瘤標(biāo)本的初步應(yīng)用：①通過免疫組織化學(xué)方法檢測到增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（O6-Methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）、CD133、巢蛋白Nestin、增殖細(xì)胞相關(guān)的核抗原Ki-67、Notch2、基質(zhì)蛋白金屬酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、野生型p53-誘導(dǎo)的蛋白磷酸酶1（thewild-type P53-induced phosphatase 1，Wip1）在83例腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況，進(jìn)行生存分析，已經(jīng)得到初步數(shù)據(jù)。②從膠質(zhì)瘤標(biāo)本中所提取的RNA經(jīng)核酸定量儀檢測，具有較高純度（OD260/280比值1.8～2.1），瓊脂糖凝膠電泳有清晰的28s，18s及5s，說明提取的RNA完整。③腦膠質(zhì)瘤患者全血標(biāo)本和腫瘤組織中提取的基因組DNA，經(jīng)核酸定量儀檢測，其OD260/280比值為1.85～2.00，適合進(jìn)行腫瘤的基因組學(xué)研究。④以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品，BCA法蛋白定量檢測試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度與標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合良好。⑤應(yīng)用半定量－聚合酶連反應(yīng)和Westernblot的方法對膠質(zhì)瘤中某些基因表達(dá)進(jìn)行了基因和蛋白水平的檢測，得出Notch2、MMP-9、Wip1等指標(biāo)在腦膠質(zhì)瘤組織中存在mRNA和蛋白水平高表達(dá)。

3 討 論

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷提高，實(shí)驗(yàn)條件的不斷完善，創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)腫瘤標(biāo)本庫已經(jīng)受到一些發(fā)達(dá)國家的政府和研究機(jī)構(gòu)的重視［2］。目前，國內(nèi)許多腫瘤研究單位都建立或開始著手籌建自己的腫瘤資源庫［3－5］。隨著社會保障體系完善提高及醫(yī)療技術(shù)的革新，腦膠質(zhì)瘤發(fā)病率呈逐年增高的趨勢，腦膠質(zhì)瘤作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性的顱內(nèi)惡性腫瘤之一，手術(shù)、放化療等綜合治療并未能防止腫瘤浸潤性生長及復(fù)發(fā)，最終危及患者生命。要實(shí)現(xiàn)有效的治療及防止膠質(zhì)瘤術(shù)后的復(fù)發(fā)，必須對膠質(zhì)瘤分子生物學(xué)特性進(jìn)行深入研究。

手術(shù)切除的膠質(zhì)瘤標(biāo)本是膠質(zhì)瘤基礎(chǔ)與臨床研究的必備材料，是不可再生資源。提供確診的、合乎科研設(shè)計(jì)要求的膠質(zhì)瘤標(biāo)本和膠質(zhì)瘤患者的血清標(biāo)本以及正常對照標(biāo)本，有利于充分有效利用膠質(zhì)瘤資源，為膠質(zhì)瘤的基礎(chǔ)和臨床研究工作提供平臺。我們應(yīng)用目前庫存膠質(zhì)瘤標(biāo)本，通過檢測膠質(zhì)瘤標(biāo)本組織中MGMT甲基化情況，對于指導(dǎo)膠質(zhì)瘤患者的化療起到了重要意義［6］。另外，我們研究得出Wip1在高級別膠質(zhì)瘤組織中存在高表達(dá)，并與患者預(yù)后差相關(guān)［7］。

目前，我科對腦膠質(zhì)瘤的標(biāo)本庫建立與管理已經(jīng)取得了初步經(jīng)驗(yàn)，取材技術(shù)路線已經(jīng)基本成熟和規(guī)范。為了獲取合格的、能夠滿足科學(xué)研究的需要，在膠質(zhì)瘤的整個(gè)取材過程中我們已經(jīng)得到初步經(jīng)驗(yàn)。首先，在對膠質(zhì)瘤組織選取上，應(yīng)該避免壞死腫瘤組織區(qū)域，避免對標(biāo)本反復(fù)電凝燒灼，離體組織標(biāo)本應(yīng)該用冰鹽水清洗后盡快放入固定液中進(jìn)行保存，以避免標(biāo)本組織中的DNA、RNA和蛋白的降解；取材過程中應(yīng)該遵循無菌原則，避免外源性污染，操作過程需戴手套，所使用的器械、吸頭和凍存管等使用前須經(jīng)高壓消毒處理。另外，保存標(biāo)本時(shí)，應(yīng)分裝成多管，以便標(biāo)本以管為單位出庫，避免反復(fù)凍融，標(biāo)本一旦出庫即不能再入庫。

ESTABLISHMENT AND MANAGEM ENT OF GLIOMAS TISSUES BANK

JIAO Baohua，LIANG Chaohui，WANG Yuanyu，SUN Shian，XIZenghui
（Department of Neurosurgery，the Second Hospital of HebeiMedical University，Shijiazhuang，050000，China）

glioma；biological specimen banks；organization and administration

R739.41

A

1007-3205（2013）04-0388-03

2012－06－12；

2012－09－17

焦保華（1954－），男，河北辛集人，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院主任醫(yī)師，教授，醫(yī)學(xué)博士，從事神經(jīng)外疾病診治研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.04.006

【關(guān)鍵詞】ABSTRACT：ObjectiveTo protect and utilize the tumour tissue resources fully and provide a suitable number of glioma tissues for studying the disease，the glioma bank was established.M ethodsThe tumour tissueswere collected during operation，including tumour，adjacent non-cancerous tissue and the serum of patientswere obtained before operation.RNA，DNA and protein of the tissueswere collected and stored with liquid nitrogen.A set of detailed information of the patients was recorded.ResultsGenomic DNA and RNA were extracted from the whole blood and tumor tissue of glioma patients，whose OD260/280 ratioswere between 1.8－2.1.The protein was extracted from glioma tissues，which could meet the need ofmolecular biology research by the bicinchoninic acid（BCA）protein assay detection.Conclusion A certain size of glioma tissue bank and a set of related methods have been established and formed for supplying a service platform of glioma research in the future.