唐玉蘭，梁慶模，莫清華，金 軍

(1衡陽市第一人民醫(yī)院，湖南衡陽421002;2南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院)

目前，有關(guān)miRNA與結(jié)腸癌的報(bào)道較多，研究發(fā)現(xiàn)，miR-143、miR-320、miR-200c 等可通過靶向不同的靶基因抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移［1～4］。miR-124 在肝癌和宮頸癌組織中表達(dá)下調(diào)，可通過靶向CDK6抑制髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與浸潤(rùn)，也可通過靶向ITGB1抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌的生長(zhǎng)［5～9］。然而，關(guān)于 miR-124在結(jié)腸癌中的表達(dá)情況、生物學(xué)功能以及參與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制尚不明確。2010年9月～2012年6月，本研究采用 MTT、細(xì)胞劃痕、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)觀察miR-124在人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞中的生物學(xué)行為，為進(jìn)一步闡明結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為結(jié)腸癌的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料 人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞，來自南華大學(xué)腫瘤研究所。

1．2 方法

1．2．1 細(xì)胞培養(yǎng) 人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)為10%的滅活小牛血清(BSA)RPMI 1640培養(yǎng)基(Hyclone，美國(guó))中，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱(Forma，美國(guó))內(nèi)培養(yǎng)傳代。細(xì)胞呈單層生長(zhǎng)，鋪滿培養(yǎng)瓶后傳代;傳代時(shí)常規(guī)倒掉培養(yǎng)液，用胰蛋白酶消化;在倒置顯微鏡(Olympus，日本)下觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大后，立即傾去胰酶，加適量含血清培養(yǎng)液吹打成單細(xì)胞懸液，按所需濃度接種。

1．2．2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR-124成熟體用于轉(zhuǎn)染后上調(diào)細(xì)胞內(nèi)miR-124表達(dá)，轉(zhuǎn)染濃度為40μmol/L。接種細(xì)胞于6/96孔板或50 mL培養(yǎng)瓶中，在完全培養(yǎng)基中細(xì)胞生長(zhǎng)至30% ～50%;在無菌EP管中，采用Lipofectamin 2000TM轉(zhuǎn)染;室溫下放置 20 min，使DNA與脂質(zhì)體形成復(fù)合體，用無血清培養(yǎng)液洗滌培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞。往復(fù)合體中加入無血清的培養(yǎng)液(不含抗生素)，溫和混勻，加入到待轉(zhuǎn)染的6/12/24/96孔板或50 mL培養(yǎng)瓶中;置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，放置24～48 h。同時(shí)，設(shè)置miR-124陰性對(duì)照。

1．2．3 細(xì)胞生長(zhǎng)能力觀察 采用MTT實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)轉(zhuǎn)染miRNA以及對(duì)照的細(xì)胞達(dá)到75%～80%密度時(shí)，D-Hanks液洗2遍。消化細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。接種細(xì)胞于96孔板中，每孔體積200μL接種3×103個(gè)細(xì)胞，重復(fù)6孔。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～72 h，每孔加5 mg/mL的MTT液20μL呈色。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h，終止并去除培養(yǎng)液。每孔再加入150μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物溶解。選擇490 nm波長(zhǎng)，MTT比色，測(cè)定各孔吸光度值并記錄結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，繪制MTT曲線。

1．2．4 細(xì)胞遷移能力觀察 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。將瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-124成熟體和陰性對(duì)照的細(xì)胞接種于6孔板，待之長(zhǎng)至臨近飽和。用10μL的Eppendorf Tip消毒后在細(xì)胞板上劃痕，并將細(xì)胞洗滌2～3遍。加含5%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，倒置顯微鏡下觀察24、48 h各組細(xì)胞的變化并攝像。測(cè)量各組細(xì)胞任意3個(gè)部位的不同傷口的寬度，測(cè)算0 h與12、24 h的傷口愈合率，即0 h傷口寬度與12、24 h傷口寬度的差值與0 h傷口寬度的比值。計(jì)數(shù)3組實(shí)驗(yàn)的平均值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1．2．5 細(xì)胞侵襲能力觀察 采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。用鑷子夾住 Transwell小室浸泡在 500μL 1∶100基質(zhì)膠中約5 min，取出 Transwell并晾干;將Transwell放入24孔板中，過夜干燥。在Transwell的上室內(nèi)加入50μL基質(zhì)膠，加入200μL無酶水/孔，直至干燥。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%，加入MEM培基(含5%胎牛血清)。將Tranwell預(yù)熱至37℃，每孔加入200μL侵襲緩沖液(2 mL BSA+38 mL RPMI 1640培基)，37℃放置1 h。無血清培基洗滌后消化，1 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞。有血清的培基重懸細(xì)胞沉淀后，1 000 r/min離心5 min，放置細(xì)胞15 min。PBS洗2次，1 000 r/min離心10 min，5 mL侵襲緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2．5×105/mL。通過間隙加入800μL Fibronectin Solution到下腔。在上腔內(nèi)加入200μL細(xì)胞懸液，在過濾器上均勻布滿后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)36～38 h。10%甲醛中固定Transwell 10 min，自來水清洗2次。將Transwell加入結(jié)晶紫中5 min，自來水清洗后放入40℃溫水泡10 min。將培養(yǎng)小室倒置晾干中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察、照相。隨機(jī)選取4個(gè)低倍視野(×100)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并計(jì)算平均值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3次。

1．2．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以ˉx±s表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析。P≤0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 miR-124對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)能力的影響 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-124對(duì)人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，轉(zhuǎn)染miR-124成熟體及其陰性對(duì)照24、48、72 h后，人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞OD值分別為0．287±0．010、0．353 ±0．006、0．376 ±0．007，對(duì)照組分別為 0．436±0．014、0．551 ± 0．015、0．642 ± 0．021，P 均 ＜0．05。

2．2 miR-124對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-124對(duì)人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力影響，轉(zhuǎn)染miR-124成熟體12、24 h后傷口愈合率分別為26．5% ± 0．7%、37．7% ± 1．5%，其陰性對(duì)照分別為 40．6% ±2．5%、78．2% ±1．6%，P 均 ＜0．05。見插頁Ⅱ圖6。

2．3 miR-124對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-124對(duì)人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞穿膜能力的影響，轉(zhuǎn)染miR-124成熟體及其陰性對(duì)照24 h后，穿過基底膜的SW620細(xì)胞數(shù)分別為(37±2．6)個(gè)和(80 ±3．6)個(gè)，P ＜0．05。見插頁Ⅱ圖7。

3 討論

結(jié)腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，在所有惡性腫瘤中發(fā)病率居第3位，且其發(fā)病率每年呈上升趨勢(shì)。全世界每年新發(fā)結(jié)腸癌大約有120萬例，我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病率和病死率增長(zhǎng)迅速，部分城市已經(jīng)達(dá)到或超過西方發(fā)達(dá)國(guó)家水平，成為僅次于肺癌的高發(fā)惡性腫瘤［10］。目前，對(duì)于結(jié)腸癌的形成、發(fā)展、預(yù)后以及治療都有了新的認(rèn)識(shí)，但要治愈和預(yù)防結(jié)腸癌的發(fā)生，關(guān)鍵問題是了解結(jié)腸癌的病因及發(fā)病機(jī)制。但是，仍然有較多的患者因?yàn)槿狈τ行У闹委熓侄味劳觯虼?，很有必要進(jìn)一步研究結(jié)腸癌的致癌效應(yīng)并尋找出新的治療策略。

miRNA的表達(dá)失調(diào)或功能異常，可能導(dǎo)致包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生。越來越多的研究顯示，在人類腫瘤中存在miRNA表達(dá)失調(diào)，miRNA發(fā)揮癌基因和抑癌基因的功能參與細(xì)胞增殖、凋亡和分化的調(diào)控，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能［2，3］。Ghanta 等［11］通過自己建立的人類miRNA疾病數(shù)據(jù)庫整理出幾十個(gè)致瘤miRNA和抑瘤miRNA，并對(duì)其功能、表達(dá)、進(jìn)化、基因組分布、靶基因及轉(zhuǎn)錄因子等進(jìn)行了全面的系統(tǒng)生物學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)在功能上致癌miRNA更傾向于促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制凋亡、抑制免疫細(xì)胞發(fā)育、控制細(xì)胞周期等，而抑癌miRNA更傾向于抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)凋亡等。關(guān)于miRNA可作為癌基因或抑瘤基因參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的報(bào)道越來越多。文獻(xiàn)表明，miR-124在肝癌和宮頸癌組織中表達(dá)下調(diào)，miR-124可通過靶向CDK6抑制髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與浸潤(rùn)，也可通過靶向ITGB1抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌的生長(zhǎng)［5～8］。miR-124 與 miR-137 能促進(jìn) CD+133腫瘤干細(xì)胞的分化，抑制癌細(xì)胞的增殖，細(xì)胞周期蛋白激酶CDK6是它們的作用靶點(diǎn)［9］。因此，miR-124可能作為抑癌miRNA參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。鑒于此，我們?cè)谙乱徊降恼n題中，深入miR-124在結(jié)腸癌中研究將可能進(jìn)一步了解結(jié)腸癌的分子病理機(jī)制。本研究結(jié)果表明，miR-124可顯著抑制人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞生長(zhǎng)及運(yùn)動(dòng)能力，過表達(dá)miR-124可顯著抑制人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞的侵襲能力。因此，我們初步推測(cè)miR-124在結(jié)腸癌中可能發(fā)揮抑癌基因的作用。

綜上所述，miRNA作為癌基因或抑癌基因功能的發(fā)現(xiàn)為腫瘤病因及發(fā)病機(jī)制的研究提供了新思路，也為腫瘤預(yù)防及腫瘤分型、診斷、預(yù)后判斷、指導(dǎo)用藥、療效監(jiān)測(cè)甚至輔助治療提供了新策略［12，13］。繼續(xù)深入miR-124與結(jié)腸癌關(guān)系的研究，闡明miR-124參與結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，可為結(jié)腸癌的防治提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

［1］Pobirci DD，Bogdan F，Pobirci O，et al．Study of malignant fibrous histiocytoma:clinical，statistic and histopatological interrelation［J］．Rom J Morphol Embryol，2011，52(Suppl 1):385-388．

［2］Pichler M，Winter E，Stotz M，et al．Down-regulation of KRAS-interacting miRNA-143 predicts poor prognosis but not response to EGFR-targeted agents in colorectal cancer［J］．Br JCancer，2012，106(11):1826-1832．

［3］Sun JY，Huang Y，Li JP，et al．MicroRNA-320a suppresses human colon cancer cell proliferation by directly targeting β-catenin［J］．Biochem Biophys Res Commun，2012，420(4):787-792．

［4］Chen ML，Liang LS，Wang XK，et al．miR-200c inhibits invasion and migration in human colon cancer cells SW480/620 by targeting ZEB1［J］．Clin Exp Metastasis，2012，29(5):457-469．

［5］Wilting SM，van Boerdonk RA，Henken FE，Methylation-mediated silencing and tumour suppressive function of hsa-miR-124 in cervical cancer［J］．Mol Cancer，2010，9(1):167．

［6］Furuta M，Kozaki KI，Tanaka S．miR-124 and miR-203 are epigenetically silenced tumor-suppressive microRNAs in hepatocellular carcinoma［J］．Carcinogenesis，2010，31(5):766-776．

［7］Li KK，Pang JC，Ching AK，et al．miR-124 is frequently downregulated in medulloblastoma and is a negative regulator of SLC16A1［J］．Hum Pathol，2009，40(9):1234-1243．

［8］Pierson J，Hostager B，F(xiàn)an R，et al．Regulation of cyclin dependent kinase6 by microRNA 124 in medulloblastoma［J］．JNeurooncol，2008，90(1):1-7．

［9］Hunt S，Jones AV，Hinsley EE，et al．MicroRNA-124 suppresses oral squamous cell carcinoma motility by targeting ITGB1［J］．FEBSLett，2011，585(1):187-192．

［10］Bacci G，Longhi A，F(xiàn)agioli F，et al．Adjuvant and neoadjuvant chemotherapy for colon cancer of the extremities:27 year experience at Rizzoli Institute，Italy［J］．Eur J Cancer，2005，41(18):2836-2845．

［11］Ghanta KS，Li DQ，Eswaran J，et al．Gene profiling of MTA1 identifies novel gene targets and functions［J］．PLoS One，2011，6(1):e17135．

［12］Hamano R，Miyata H，Yamasaki M，et al．Overexpression of miR-200c induces chemoresistance in esophageal cancers mediated through activation of the Akt signaling pathway［J］．Clin Cancer Res，2011，17(9):3029-3038．

［13］Voortman J，Goto A，Mendiboure J，et al．MicroRNA expression and clinical outcomes in patients treated with adjuvant chemotherapy after complete resection of non-small cell lung carcinoma［J］．Cancer Res，2010，70(21):8288-8298．