于佳動(dòng)，蔡靜平，王欽宏

（1.河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308）

0 引言

酵母單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一類位于細(xì)胞質(zhì)膜的重要跨膜蛋白，負(fù)責(zé)將胞外的糖類轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)供細(xì)胞代謝利用，在促進(jìn)單糖的吸收、代謝方面具有重要的生物學(xué)功能[1].近年來，人們在研究以酵母菌作為轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素水解液的菌種生產(chǎn)燃料乙醇等高附加值生物基產(chǎn)品過程中，發(fā)現(xiàn)單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可顯著提高木質(zhì)纖維素水解液轉(zhuǎn)化乙醇的速率，改善生物轉(zhuǎn)化利用度，因而對該蛋白的深入研究被廣泛關(guān)注，成為目前該類糖轉(zhuǎn)化利用的關(guān)鍵問題[2].

糖的代謝是從胞外轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)開始的，對于細(xì)胞糖轉(zhuǎn)運(yùn)的研究主要集中在己糖轉(zhuǎn)運(yùn)的生理生化性質(zhì)方面，而在糖由胞外進(jìn)入胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)如何影響糖的代謝利用研究相對較少.研究表明糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力的差異可改變酵母菌的生長和代謝速率，進(jìn)而限制了代謝終端產(chǎn)物濃度的提高，因此，糖轉(zhuǎn)運(yùn)是糖代謝利用的限速步驟之一[3].隨著研究手段的進(jìn)步，尤其是微生物基因組學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一些具有天然利用五碳糖能力的酵母陸續(xù)完成基因組解析[4]，使得研究酵母單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白從釀酒酵母逐漸擴(kuò)展到其他多種酵母，特別是一些能夠利用天然木糖的酵母更是成為研究的重點(diǎn).

1 酵母菌單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究方法和分類系統(tǒng)

從基因組出發(fā)探究酵母單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列信息是最直接、最有效率的研究手段.通過對不同酵母cDNA文庫序列及基因組信息的收集，與已知菌種的單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列比對，可以挖掘出新菌種可能具有單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白性質(zhì)的序列，再通過功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)即可能揭示新菌種單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的性質(zhì).例如，研究和應(yīng)用較多的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)[5]、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)[6]和樹干畢赤酵母(Pichia stipitis)等菌種在利用己糖和五碳糖上顯示出不同的特性，人們對它們的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白均有較充分的研究.研究者通常以這些已知菌種為依據(jù)，利用GenBank上公布的各種酵母菌的基因組序列，挖掘?qū)Σ煌瑔翁堑孜镛D(zhuǎn)運(yùn)偏好性高的單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白.進(jìn)一步將這些新發(fā)現(xiàn)的酵母單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行基因、蛋白質(zhì)序列的比對、系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析，即可將它們歸屬于協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)擴(kuò)散超家族（Major facilitator superfamily,MFS）[7]，從而不斷豐富酵母單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白比對源.

酵母中負(fù)責(zé)糖轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白種類繁多.研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在釀酒酵母6 000多個(gè)基因中，編碼糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因有35個(gè)，其他酵母菌也具有相同的特性.為了方便對已知糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的查找和研究、利用，國外研究者建立了一個(gè)專門收錄轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列信息的數(shù)據(jù)庫——轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分類系統(tǒng)（The Transporter Classification，TC）[8]，該系統(tǒng)將不同來源的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以序列同源性、宿主和功能為依據(jù)進(jìn)行了分類，共分為兩大超家族，除酵母糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白屬于MFS超家族外，另一類為腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族（ATP-binding cassette transporter superfamily，ABC transporter superfamily），細(xì)菌糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白一般屬于此類超家族[9].

在TC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分類系統(tǒng)中，MFS超家族又被分為17個(gè)不同的家族，最大的是糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族（Sugar Porter Family）編號為TC#2.A.1.1.與工業(yè)發(fā)酵、釀酒工業(yè)、木質(zhì)纖維素水解液利用相關(guān)的釀酒酵母己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族（HXT）、粟酒裂殖酵母高特異性葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族（Ght）、樹干畢赤酵母糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族(SUT1-3)等均收錄其中.

另有一個(gè)專門針對酵母糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的數(shù)據(jù)庫——酵母轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白數(shù)據(jù)庫（Yeast Transporter Protein Database）,可以對酵母單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行功能注釋結(jié)果進(jìn)行分類或預(yù)測其功能.根據(jù)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白數(shù)據(jù)庫收錄的信息，以同源性為依據(jù)去尋找其他酵母中新的單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列，不斷發(fā)現(xiàn)新的高效單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白.

2 酵母菌單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象決定蛋白質(zhì)的功能.具有相同空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)在氨基酸組成、功能方面均具有一定的共性.對酵母單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白保守性分析也印證了上述觀點(diǎn)[10-11].對酵母單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白空間結(jié)構(gòu)的分析有助于了解其轉(zhuǎn)運(yùn)單糖的生物學(xué)功能，同時(shí)，通過分析結(jié)構(gòu)，聯(lián)系功能信息也可為轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理的揭示和結(jié)構(gòu)功能的改造奠定基礎(chǔ).

人們在研究轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)，酵母單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通常由400～600個(gè)氨基酸殘基組成，N端和C端都在細(xì)胞質(zhì)的一側(cè).MFS超家族糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的二級結(jié)構(gòu)一般是由12個(gè)跨膜疏水α螺旋組成的，在有些酵母中也發(fā)現(xiàn)含有6個(gè)、14個(gè)或24個(gè)的疏水跨膜螺旋[12].含14個(gè)跨膜螺旋的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是由兩個(gè)位于胞內(nèi)中間的環(huán)狀結(jié)構(gòu)α螺旋插入到細(xì)胞膜中形成的，而含有24個(gè)疏水跨膜螺旋結(jié)構(gòu)可能是由于早期進(jìn)化過程中形成了二聚體.但是，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在螺旋數(shù)量上的差異并不影響糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能[13].

由于MFS超家族蛋白屬于膜蛋白，在與膜分離純化過程中存在一定難度，三級結(jié)構(gòu)解析方面的研究還很少，第一個(gè)高分辨率的三級結(jié)構(gòu)直到2003年才被純化出來，是由Abramson等[14]解析出負(fù)責(zé)乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)的乳糖透過酶（LacY）蛋白的三級結(jié)構(gòu).2012年，清華大學(xué)的顏寧研究小組通過對大腸桿菌中負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)木糖的XylE轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白晶體結(jié)構(gòu)的分析，也呈現(xiàn)出典型的MFS超家族折疊方式[15].MFS超家族的12個(gè)跨膜α螺旋分成兩個(gè)亞基，呈現(xiàn)出一種向細(xì)胞外側(cè)開放接收糖類、部分封閉的構(gòu)象.基于MFS超家族在結(jié)構(gòu)和功能上表現(xiàn)出的共性，根據(jù)氨基酸序列模擬酵母單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)，均表現(xiàn)出MFS超家族的特征[16].但是，迄今為止還未見有高分辨率酵母單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白晶體的報(bào)道.

3 酵母菌單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制及表達(dá)調(diào)控

酵母菌單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)過程及其機(jī)制是人們一直非常關(guān)注的重點(diǎn)之一，目前已經(jīng)從分子水平揭示了糖從被轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白識別、結(jié)合、至釋放的整個(gè)動(dòng)態(tài)過程.在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MFS超家族中，酵母單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白依靠兩種方式進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，一種是依靠胞內(nèi)外濃度梯度進(jìn)行促進(jìn)擴(kuò)散（Facilitated diffusion），另一類則是依靠質(zhì)子動(dòng)力的H+協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（H+Symporter transporter） 或 Na+協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 （Na+Symporter transporter）[17]來實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)運(yùn)過程.

那七八個(gè)男人每人一棍，有揍他背的，有揍他胸的，有揍他腰的，有揍他腿……癩阿小一下挨了七八棍，就像一條死狗那樣賴在地上，哭啊喊啊叫啊……當(dāng)然不忘向他們求饒，最后輪到白天明，他接過木棍，對癩阿小說：“我去年就想揍你了，你個(gè)畜生賊性不改，今年我可得讓你長點(diǎn)記性了?！卑滋烀鲓^力一棍下去，嚓！只聽得癩阿小一聲慘叫，他的右腿斷了。

酵母菌單糖轉(zhuǎn)運(yùn)首先涉及底物識別和釋放的過程，Jardetzk等[18]提出了“交替通路”的機(jī)制，認(rèn)為在糖轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，整個(gè)過程不涉及到底物位點(diǎn)的變化，只涉及蛋白構(gòu)象的變化，使底物結(jié)合位點(diǎn)交替開口于膜內(nèi)外兩側(cè)，交替變化，最終完成糖的轉(zhuǎn)運(yùn).Smirnova等[19]通過對單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因lacY的研究，提出了搖桿理論，該理論也與底物結(jié)合后引起轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)象變化有關(guān)，認(rèn)為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以底物結(jié)合部位為軸進(jìn)行轉(zhuǎn)動(dòng)，將糖類轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的開口方向也發(fā)生了變化，由最初的向外開口變成向內(nèi)開口，這種理論后來又得到Kaback實(shí)驗(yàn)室通過雙電子共振實(shí)驗(yàn)[20]、氨基酸熒光實(shí)驗(yàn)[21]、定向烷化實(shí)驗(yàn)[22]等生化實(shí)驗(yàn)證明.

糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的構(gòu)象改變也與自身氨基酸殘基參與質(zhì)子的結(jié)合、傳遞、釋放的過程有關(guān).Kilian、Gardonyi等[23-24]在對可以轉(zhuǎn)運(yùn)木糖的間型假絲酵母和樹干畢赤酵母中發(fā)現(xiàn)了Na+或H+結(jié)合的單糖:質(zhì)子同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，因細(xì)胞具有保K+排Na+性質(zhì)，細(xì)胞膜外Na+的濃度較高，即Na+的電化學(xué)梯度流向膜內(nèi)，葡萄糖依靠Na+梯度所提供的能量，通過糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，與Na+一起轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)，葡萄糖運(yùn)輸?shù)乃俣扰c胞外Na+濃度成正比，隨后Na+經(jīng)細(xì)胞膜上回路又泵回胞外，H+由于呼吸作用產(chǎn)生的電子傳遞形成膜內(nèi)外的質(zhì)子梯度產(chǎn)生流向胞內(nèi)的力參與葡萄糖的協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn).

研究者也從分子遺傳學(xué)的角度研究酵母單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用機(jī)制，他們通過分析編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在整個(gè)糖代謝過程中扮演的角色，揭示其調(diào)控的功能，闡明轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用機(jī)制.例如，釀酒酵母體內(nèi)含有18個(gè)己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（HXT1～HXT17、Gal2） 和兩個(gè)葡萄糖傳感蛋白（Rgt1p、Snf2p）[25]，用敲除掉hxt1-hxt7基因的釀酒酵母菌進(jìn) 行 功 能 互 補(bǔ) 實(shí) 驗(yàn) 證 明 HXT1～HXT4、HXT6、HXT7、Gal2為釀酒酵母體內(nèi)主要負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[3,26]，用敲除掉 hxt1～hxt17、gal2基因的釀酒酵母對 HXT8～HXT11、HXT13～HXT17 的功能驗(yàn)證，利用葡萄糖生長并不明顯，hxt12基因被插入序列阻斷，因此失去了轉(zhuǎn)運(yùn)糖的功能.部分己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在釀酒酵母染色體中的位置也已確定，hxt1、hxt4、hxt5的位置是在染色體Ⅲ上[27].HXT6、HXT7蛋白序列僅有兩個(gè)氨基酸的差異，它們的基因串聯(lián)在一起，與hxt3基因的3′末端相鄰，位于染色體Ⅵ上[28].

酵母菌單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白受基質(zhì)中葡萄糖濃度的調(diào)控，Johnston等[28]根據(jù)hxt1～hxt4基因在不同葡萄糖濃度下表達(dá)量的不同，揭示了它們在基質(zhì)中不存在葡萄糖、低濃度葡萄糖和高濃度葡萄糖情況下單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)機(jī)制.發(fā)現(xiàn)有許多蛋白質(zhì)，如葡萄糖阻遏因子Rgt1、Mig1，葡萄糖誘導(dǎo)因子Snf1、Grr1等參與了hxt1～hxt4基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控.Rgt1是一種結(jié)合在hxt1～hxt4基因前啟動(dòng)子區(qū)的阻遏物，當(dāng)基質(zhì)中不存在葡萄糖時(shí)，Rgt1抑制hxt1～hxt4基因的表達(dá).hxt3基因的轉(zhuǎn)錄與葡萄糖的濃度無關(guān)，只通過Rgt1的活性來進(jìn)行調(diào)節(jié).hxt2、hxt4基因的轉(zhuǎn)錄在無葡萄糖的情況下也受到Rgt1的阻遏，在高濃度葡萄糖中受到另一種阻遏物Mig1的阻遏，只有在低濃度的葡萄糖中，hxt2、hxt4基因才能最大限度的表達(dá).HXT1在高濃度條件下才能表達(dá)，Rgt1在高濃度葡萄糖條件下阻遏HXT1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，必須啟動(dòng)另一條信號通路才能啟動(dòng)HXT1的表達(dá)，Reg1活化Act，啟動(dòng)HXT1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄.

RenVerwace[29]在對酵母菌hxt5基因的研究中發(fā)現(xiàn)，HXT5的表達(dá)不依賴葡萄糖濃度，而是由細(xì)胞生長的速度決定，當(dāng)細(xì)胞低速生長時(shí)，hxt5基因的轉(zhuǎn)錄量增大，在細(xì)胞延遲期、穩(wěn)定期主要負(fù)責(zé)糖的轉(zhuǎn)運(yùn).此外，氧氣也是調(diào)控單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的重要因子[30-31]，樹干畢赤酵母sut1～sut3基因的表達(dá)受氧的調(diào)控，在通氧情況下，才可以表達(dá).因此，不同酵母單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)分子機(jī)制是不同的，既由基質(zhì)中葡萄糖濃度決定，也受氧濃度的調(diào)控來啟動(dòng)不同單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)錄、表達(dá).

4 酵母菌單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的分子改造與應(yīng)用

在發(fā)酵條件下，細(xì)胞面臨的環(huán)境不是一成不變的，要根據(jù)發(fā)酵具體要求選用穩(wěn)定、高效且適應(yīng)不同單糖底物的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白.因此，需要從實(shí)際應(yīng)用的角度對單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行篩選、評價(jià)和改造.除利用葡萄糖發(fā)酵外，還有在釀酒工業(yè)中應(yīng)用的果糖發(fā)酵，在食品添加劑生產(chǎn)中的應(yīng)用木糖發(fā)酵等.目前在國內(nèi)外最受關(guān)注的是木質(zhì)纖維素水解液的發(fā)酵，因?yàn)槟举|(zhì)纖維素的主要成分為纖維素和半纖維素，水解液中含有不同的單糖成分，包括葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、木糖和少量阿拉伯糖，由于基質(zhì)由混合的不同種類單糖組成，要提高糖的綜合利用率，對轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控提出了更高的要求.

現(xiàn)有的研究和應(yīng)用證明，樹干畢赤酵母、間型假絲酵母、麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa)等可以利用木質(zhì)纖維素水解液進(jìn)行發(fā)酵[2,32].樹干畢赤酵母是目前公認(rèn)發(fā)酵木糖最好的菌株之一，其單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因sut1～sut3已被克隆出來，SUT1～SUT3在2%木糖濃度環(huán)境下轉(zhuǎn)運(yùn)木糖的Km值約為20 mmol/L[31].從間型假絲酵母中克隆出的gxf1和gxs1是近年來人們研究最多的可以轉(zhuǎn)運(yùn)木糖的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，已經(jīng)被應(yīng)用到酵母工程菌的構(gòu)建，證明可以有效提高木糖的轉(zhuǎn)化效率[33].在研究Candida succiphila和Kluyveromyces marxianus兩個(gè)菌種提高木糖發(fā)酵效率的試驗(yàn)中，Stambuk等[34]發(fā)現(xiàn)兩個(gè)低親和性的木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白.在制作面包中經(jīng)常使用的得巴利漢遜酵母（Debaryomyces hansenii）單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白XylHP也被證明具有木糖轉(zhuǎn)運(yùn)的能力[35]，但在酵母菌中，目前還沒有發(fā)現(xiàn)可特異轉(zhuǎn)運(yùn)木糖的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白.

在酵母對木糖的轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)節(jié)中，目前的研究主要集中在對可利用木糖發(fā)酵酵母單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能的評價(jià).Hamacher等[36]在釀酒酵母己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能互補(bǔ)試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn) HXT4、HXT5、HXT7、Gal2 均可轉(zhuǎn)運(yùn)2%的木糖.本實(shí)驗(yàn)室的一株麥芽糖假絲酵母（Candida maltosa Xu316）可以高效利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇，轉(zhuǎn)化率達(dá)到0.85g/g，是木質(zhì)纖維素水解液利用及混合糖發(fā)酵中應(yīng)用價(jià)值較高的菌種.對其基因組基因進(jìn)行預(yù)測、注釋分析發(fā)現(xiàn)了23個(gè)假定的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中，通過功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)已驗(yàn)證出5個(gè)單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分別在2%葡萄糖、木糖濃度下發(fā)揮糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能（結(jié)果待發(fā)表）.

酵母單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不僅表現(xiàn)出對葡萄糖、木糖的親和性，果糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖也可作為不同單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物.釀酒酵母己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HXT1～HXT7可以轉(zhuǎn)運(yùn)果糖及甘露糖.Cason等在對S.pastorianus和S.bayanus發(fā)現(xiàn)了高親和性果糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[37].樹干畢赤酵母SUT1、SUT3可轉(zhuǎn)運(yùn)果糖，SUT3也可以轉(zhuǎn)運(yùn)半乳糖[31].Young等[38]對26種不同酵母來源的單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行了6種底物（葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖、果糖、核糖）轉(zhuǎn)運(yùn)能力的測試，有10種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白至少可以利用一種單糖，通過序列比對，鑒定出樹干畢赤酵母菌xut基因、解脂耶氏酵母菌(Yarrowia lipolytica)和得巴利漢遜酵母菌的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ORF.對阿拉伯糖的轉(zhuǎn)運(yùn)研究中，釀酒酵母可轉(zhuǎn)運(yùn)半乳糖的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Gal2證明也可以轉(zhuǎn)運(yùn)阿拉伯糖[39-40]，在樹干畢赤酵母中，新發(fā)現(xiàn)了可以轉(zhuǎn)運(yùn)阿拉伯糖的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AraT，與釀酒酵母菌己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Gal2相比，在阿拉伯糖（2%）消耗速率和菌體比生長速率上均比Gal2要低，但在低濃度阿拉伯糖（0.5%）情況下，AraT的轉(zhuǎn)運(yùn)效率要比Gal2高，這也印證了單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有自身獨(dú)特的性質(zhì)，外界糖濃度的高低啟動(dòng)不同單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá).由此可以看出，酵母單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白并非具有嚴(yán)格的底物特異性，與其結(jié)構(gòu)相似的單糖均可以被轉(zhuǎn)運(yùn)，只是底物的親和力大小不同，反映出轉(zhuǎn)運(yùn)速率的差異，要根據(jù)實(shí)際應(yīng)用選擇與底物親和力高的單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白.

影響單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與糖親和力的因素均為復(fù)雜.研究發(fā)現(xiàn)，酵母單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中的12個(gè)疏水跨膜螺旋中的 3、5、7、8、11 與底物的結(jié)合有關(guān)，一些芳香族氨基酸的殘基與葡萄糖或木糖結(jié)合.對MFS超家族基因GLUT1的研究中發(fā)現(xiàn)了一些影響轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能的活性位點(diǎn)，但還沒有發(fā)現(xiàn)一個(gè)氨基酸殘基的突變直接會(huì)給葡萄糖結(jié)合帶來嚴(yán)重影響的位點(diǎn).通過定點(diǎn)突變的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Asn34、Ser66、Thr295、Thr310在胞外與結(jié)合糖的能力相關(guān).突變第2和第4跨膜結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基（Gly75、Gly130），發(fā)現(xiàn)突變后的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物結(jié)合空間不協(xié)調(diào)，影響了糖的結(jié)合.

對釀酒酵母單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白H XT2和Gal2的研究中發(fā)現(xiàn)，C末端由101個(gè)氨基酸組成的區(qū)域起到對不同底物——葡萄糖、半乳糖的識別作用[10]，Kasahara將hxt2和gal2基因決定第10個(gè)疏水跨膜螺旋的12個(gè)氨基酸隨機(jī)突變，得到25 000種組合在含有半乳糖的平板中進(jìn)行功能驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)芳香族氨基酸殘基（Tyr446、Trp455）與底物的結(jié)合有關(guān)，將此殘基用另19種必需氨基酸取代，Gal2轉(zhuǎn)運(yùn)半乳糖的活性只有突變前的20%，有的喪失了轉(zhuǎn)運(yùn)半乳糖的能力.釀酒酵母己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Hxt2的研究也發(fā)現(xiàn)了影響底物識別的殘基，位于蛋白質(zhì)氨基酸431處，不同的氨基酸也會(huì)給底物的識別帶來明顯的影響.

從上述研究結(jié)果中不難發(fā)現(xiàn)，糖和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相互作用是依靠一定的殘基（芳香族氨基酸）之間的氫鍵形成一定的空間結(jié)構(gòu)來維持的，以達(dá)到最佳的底物與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的構(gòu)象效果，這與酶的基本特性相似.近年來，為了提高木質(zhì)纖維素水解液中單糖的轉(zhuǎn)化效率，尤其是木糖的轉(zhuǎn)化效率，對糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行了一些改造，提高其對底物的親和力.例如，采用定點(diǎn)突變的方法對樹干畢赤酵母菌sut3基因和間型假絲酵母菌gxs1基因進(jìn)行位點(diǎn)突變，SUT3、GXS1突變株在低濃度的葡萄糖和木糖中的生長能力相同，相比突變前提高了對木糖的利用效率[38]；Guillaume等[41]在研究提高釀酒酵母利用葡萄糖、果糖的轉(zhuǎn)化效率中，對己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HXT3在結(jié)構(gòu)預(yù)測基礎(chǔ)上，進(jìn)行了10個(gè)位點(diǎn)的突變，突變后的HXT3蛋白顯著提高了利用果糖發(fā)酵的能力.因此，改變單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物結(jié)合位點(diǎn)，可有效促進(jìn)單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合不同單糖的能力，這種基因工程手段已經(jīng)成為目前單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白應(yīng)用研究的熱點(diǎn).

5 展望

木質(zhì)纖維素來源廣泛，若能被充分利用，最有希望取代糧食和煤炭能源，成為生產(chǎn)生物基能源產(chǎn)品的主要原料.當(dāng)前利用木質(zhì)纖維素的瓶頸是水解液的轉(zhuǎn)化效率低的問題，通過研究單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可有效提高底物單糖的利用速率，進(jìn)而增加生物基產(chǎn)品的生產(chǎn)效率，這一木質(zhì)纖維素利用的攻克手段已受到越來越多研究者的重視.隨著新的單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不斷被發(fā)現(xiàn)，對其后續(xù)的研究，如功能驗(yàn)證、結(jié)構(gòu)解析、機(jī)理研究將顯得尤為重要.因此，需要從分子生物學(xué)角度進(jìn)一步深入研究單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與底物結(jié)合的關(guān)系，尤其要通過對酵母單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白關(guān)鍵氨基酸殘基位點(diǎn)的分析，實(shí)現(xiàn)對單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)優(yōu)化，從而有效提高底物與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之間的親和度；與此同時(shí)，還應(yīng)當(dāng)提高單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，及在不同糖濃度下的轉(zhuǎn)運(yùn)活性，以適應(yīng)復(fù)雜多變的發(fā)酵環(huán)境.

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