吳 超，楊盛力，趙志輝

(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院，武漢430077)

生物鐘為生物體內(nèi)一種內(nèi)在的生物節(jié)律，是地球上的生物為適應(yīng)自然環(huán)境在進(jìn)化過程中形成的，在分子水平上受到CLOCK、BMAL1(brain and muscle ARNT-like protein 1)、Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、NPAS2、CKIε、Tim、Rev-Erb、DEC 等多個生物鐘基因(Circadian Gene)的精確調(diào)控［1］。NPAS2(neuronal PASdomain protein 2)又名 MOP4，是機體維持正常生物節(jié)律所必需的基因，參與生物鐘的調(diào)控，并在細(xì)胞生長、分化凋亡、腫瘤生長抑制等諸多方面發(fā)揮重要作用，可能是一種新的抑癌基因［2］。當(dāng)其突變或缺失后，會引起節(jié)律系統(tǒng)的紊亂。本文綜合目前國內(nèi)外的研究報道，對NPAS2的研究現(xiàn)狀作一綜述。

1 NPAS2的結(jié)構(gòu)

NPAS2最早由Zhou等［3］于1996年研究小鼠大腦早期發(fā)育時發(fā)現(xiàn)，是目前發(fā)現(xiàn)的人類最大的生物鐘基因，其相對分子質(zhì)量約176．68 kb，同生物鐘基因中的Clock(Circadian Locomotor Output Cycles Kaput)基因具有同源性，同屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子bHLHPAS(Basical helix-loop-helix-PASfamily，堿性螺旋—環(huán)—螺旋/PAS結(jié)構(gòu)域)轉(zhuǎn)錄因子家族［3］。編碼NPAS2的基因定位于人類染色體2p11．2～2q13上，通過基因?qū)Ρ劝l(fā)現(xiàn)人類與小鼠的NPAS2基因具有同源性。在NPAS2多肽鏈的N端由bHLH和兩個PAS結(jié)構(gòu)域(PAS-A，PAS-B)組成，bHLH能介導(dǎo)蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用，促進(jìn)蛋白二聚體的形成。研究發(fā)現(xiàn)bHLH結(jié)構(gòu)域中有18個序列一致的氨基酸，NPAS2中的bHLH結(jié)構(gòu)域包含這18個氨基酸中的9個。緊隨bHLH其后的是由PAS-A和PAS-B兩個半保留復(fù)制區(qū)組成的PAS結(jié)構(gòu)域，PAS結(jié)構(gòu)域長約260個氨基酸，包含約60個重復(fù)的氨基酸，能介導(dǎo)與DNA的結(jié)合［4］。NPAS2的C端則是核受體連接區(qū)，負(fù)責(zé)與調(diào)節(jié)NPAS2的相關(guān)核受體結(jié)合［3］。

NPAS2的同源類似物有 NPAS1、NPAS3和NPAS4，其中NPAS1定位于人類染色體19q13．2 ～q13．3上，結(jié)構(gòu)上亦具有一個 bHLH-PAS結(jié)構(gòu)域，NPAS1的bHLH結(jié)構(gòu)域具有18個序列一致氨基酸中的 17個［3］。NPAS3和 NPAS1擁有 50．2%的相同氨基酸序列，與其他的bHLH-PAS轉(zhuǎn)錄因子家族成員的相似性較?。?］。NPAS4亦同屬于bHLH-PAS轉(zhuǎn)錄因子家族［6］。

2 NPAS2的表達(dá)與分布

NPAS2在人體中廣泛表達(dá)分布，研究已證實NPAS2不僅存在于最早被發(fā)現(xiàn)的大腦中，在除睪丸之外的人體所有周圍組織中幾乎均有表達(dá)分布，在中樞系統(tǒng)主要分布于生物節(jié)律中心—視神經(jīng)交叉核，并在人前腦分布廣泛［7～9］。

人體生物節(jié)律形成有賴于NPAS2的正常表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)NPAS2異常表達(dá)時，與晝夜節(jié)律性相關(guān)的疾病如高血壓、代謝綜合征、腫瘤、心腦血管疾病等發(fā)病率可能增加［10，11］。Englund 等［11］研究認(rèn)為生物鐘基因的異常表達(dá)可能是代謝綜合征的危險因素之一，并指出 NPAS2及其異構(gòu)體 NPAS-rs11541353與高血壓的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，而其等位基因是高血壓發(fā)生的保護(hù)因素。Bruder-Nascimento等研究發(fā)現(xiàn)NPAS2的表達(dá)還可能與性成熟和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)［12］，同時 Kovanen 等［13］亦發(fā)現(xiàn) NPAS2與人的生育周期和機體季節(jié)性變化相關(guān)。

此外，研究發(fā)現(xiàn)NPAS2在腫瘤組織中存在異常表達(dá)。NPAS2的高表達(dá)能提高乳腺癌患者生存率，與乳腺癌的預(yù)后相關(guān)，Yi等通過提取乳腺癌組織中DNA，采用TaqMan等位基因分析方法分析NPAS2基因型，并做了與臨床病理結(jié)果的相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)NPAS2的高表達(dá)與患者無瘤生存和總體生存率緊密相關(guān)，提出NPAS2有望成為一項新的判斷乳腺癌預(yù)后的敏感指標(biāo)［2］。2007年Zhu等研究發(fā)現(xiàn)，有功能的NPAS2能改善非霍奇金淋巴瘤致病敏感性，NPAS2有可能成為NHL新的一種腫瘤標(biāo)志物［14］。Zhu等［15］在檢測了其他十余個生物鐘基因后對比發(fā)現(xiàn)與前列腺癌發(fā)生關(guān)系最密切的就是NPAS2。

3 NPAS2表達(dá)的調(diào)節(jié)

3．1 維甲酸相關(guān)孤兒受體調(diào)節(jié)因子調(diào)節(jié)NPAS2表達(dá) Takeda等［16］證實維甲酸相關(guān)孤兒受體 γ(RORγ)能在體內(nèi)直接調(diào)節(jié)NPAS2蛋白結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。RORγ因子缺乏能顯著降低NPAS2 mRNA表達(dá)的峰值，但不會影響NPAS2對生物節(jié)律的調(diào)節(jié)。并且證實NPAS2依賴的RORγ激活方式是通過在其近端啟動子上結(jié)合兩個ROREs反應(yīng)元件啟動其轉(zhuǎn)錄。相反的，過表達(dá)的RORγ在肝癌(Hepa1-6)細(xì)胞系中能極大地誘導(dǎo)NPAS2表達(dá)，從而上調(diào)其功能。另外，孤核受體編碼蛋白REV-ERB-α能抑制NPAS2表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)REV-ERB-α能與NPAS2和CLOCK以激素依賴性的方式結(jié)合，抑制NPAS2/BMAL1異二聚體的表達(dá)［17］。RORs和 REV-ERBs能競爭性地與BMAL1啟動子結(jié)合并抑制BMAL1的表達(dá)。實驗中發(fā)現(xiàn)這一抑制過程亦可通過REVErbα和另外ROR反相激動劑(如T0901317)的共表達(dá)來實現(xiàn)［16］。

3．2 一氧化碳(CO)和NAD(P)H調(diào)節(jié)NPAS2表達(dá) Uchida等［18］研究發(fā)現(xiàn)在 CO缺乏的情況下，NPAS2容易與BMAL1形成異源二聚體，而在CO存在下，促進(jìn)NPAS2/BMAL1與靶DNA的解離。NAD(P)H能增加NPAS2/BMAL1異源二聚體與靶DNA的結(jié)合，促進(jìn)其表達(dá)。另外，Dioum等［19］認(rèn)為NPAS2表達(dá)有可能受到氣體反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)。并推測NPAS2/BMAL1異二聚體與其靶基因的表達(dá)受到血紅素基傳感器上的氣體調(diào)控。他們通過比較在不同CO濃度下NPAS2異聚體與DNA的結(jié)合情況發(fā)現(xiàn)，在低摩爾濃度下抑制holo-NPAS2與目的DNA的結(jié)合，而apo-NPAS2結(jié)合活性不變，當(dāng)暴露于高濃度CO環(huán)境中時，不能形成NPAS2/BMAL1異聚體，而是形成無活性的BMAL1同型二聚體，從而使NPAS2的表達(dá)下調(diào)。

3．3 Per與Cry蛋白形成異源性二聚體調(diào)節(jié)NPAS2表達(dá) McNamara等［20］發(fā)現(xiàn)Per與Cry蛋白能形成異源性二聚體來抑制CLOCK/BMAL1(或NPAS2/BMAL1)的活性來抑制NPAS2的效應(yīng)反饋回路。其抑制方式是作為負(fù)性元件與NPAS2/BMAL1直接結(jié)合并抑制其活性，阻遏Per1-3和Cry1-2的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而使其表達(dá)下調(diào)。同時，Reick等［7］認(rèn)為Cry1可能是NPAS2/BMAL1轉(zhuǎn)錄因子的特異性抑制因子。Cry介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄阻遏的可能原因之一是降低了CLOCK或BMAL1的磷酸化［21］。Cry1因子有可能在提高內(nèi)源性Cry1水平的情況下來對抗NPAS/BMAL1異二聚體的作用。而實驗亦證實 NPAS/BMAL1異二聚體能對抗Cry1的轉(zhuǎn)錄激活，對于未參與生物節(jié)律控制基因，Cry1對其的啟動子無抑制作用。

4 NPAS2的主要功能

4．1 調(diào)節(jié)生物節(jié)律 NPAS2與 BMAL1形成的NPAS/BMAL1異二聚體與靶基因啟動子E-box結(jié)合，能夠調(diào)控另外兩個生物鐘基因Per和Cry的表達(dá)，起到調(diào)節(jié)生物鐘節(jié)律的作用［20］。因此NPAS2可能是機體維持正常生物節(jié)律所必需的基因，當(dāng)其突變或缺失后，會引起生物節(jié)律系統(tǒng)的紊亂。CLOCK和NPAS2的同源性造成了二者之間功能上的相似性和重疊性，Crumbley等［22］發(fā)現(xiàn)缺少BMAL1的小鼠完全喪失了晝夜節(jié)律，而CLOCK突變的個體卻并不表現(xiàn)出嚴(yán)重的癥狀，這可能正是由于CLOCK的同源類似物NPAS2代替其作用造成的。他們將NPAS2基因敲除的小鼠同CLOCK和NPAS2同時敲除的小鼠比較，后者更明顯的喪失晝夜節(jié)律性，由此推斷二者在生物節(jié)律調(diào)節(jié)上有角色重疊。

Bertolucci等［23］研究發(fā)現(xiàn)NPAS2能夠在外周體液系統(tǒng)中、外周血管中發(fā)揮節(jié)律作用［18］。將小鼠的前腦細(xì)胞置于完全黑暗中持續(xù)培養(yǎng)72 h后，NPAS2/BMAL1異二聚體控制的生物鐘基因能持續(xù)表達(dá)并表現(xiàn)出節(jié)律性。同時NPAS2在血管系統(tǒng)中顯示一個強勁的周期性表達(dá)模式，并能轉(zhuǎn)換Per2的震蕩頻率，由此間接證明了在外周血管中分子時鐘的存在。另外，Turek等［24］研究發(fā)現(xiàn)，NPAS2與CLOCK在中樞生物鐘功能上的角色重疊可能是二者存在競爭作用，但是在外周系統(tǒng)中這種競爭尚未發(fā)現(xiàn)。

4．2 參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展 腫瘤發(fā)生涉及細(xì)胞的損傷、凋亡、DNA損傷修復(fù)等過程，NPAS2基因可能與這些過程相關(guān)。NPAS2能夠通過對腫瘤相關(guān)的生物學(xué)通道來影響腫瘤的形成和生長，而且NPAS2還參與DNA損傷修復(fù)反應(yīng)［2］。NPAS2與細(xì)胞損傷、凋亡有關(guān)的熱休克蛋白90(HSP90)與多環(huán)芳香烴(AH)受體作用的發(fā)揮相關(guān)［3］。AH受體是由其第二位的bHLHPAS結(jié)構(gòu)發(fā)揮最關(guān)鍵作用，而NPAS2中與缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)和內(nèi)皮細(xì)胞PAS結(jié)構(gòu)域蛋白(EPAS)1中類似的bHLH-PAS結(jié)構(gòu)域可能激活哺乳動物基因響應(yīng)缺氧的表達(dá)，這可能與細(xì)胞的缺氧損傷、凋亡相關(guān)。

Aaron等［25］通過細(xì)胞培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)NPAS2能夠影響細(xì)胞周期變化。他們發(fā)現(xiàn)經(jīng)誘變劑處理后，具有正常NPAS2的細(xì)胞更多停留于G1或G2期，S期細(xì)胞減少，而G期正是DNA損傷修復(fù)的關(guān)鍵點，與之對比，NPAS2敲除的細(xì)胞周期無明顯變化。NPAS2基因敲除后的細(xì)胞損傷修復(fù)功能會明顯下降。他們研究了在MCF-7細(xì)胞系中，NPAS2沉默對已證實影響DNA損傷的84個基因表達(dá)的影響:與NPAS2表達(dá)正常的細(xì)胞相比，有74個(91．4%)表達(dá)下調(diào)，22個(27．2%)下調(diào)2倍或更多，只有7個基因表現(xiàn)出表達(dá)增加(8．6%)，而其中無顯著性差異。

研究發(fā)現(xiàn)CLOCK/BMAL1能夠調(diào)控與細(xì)胞周期相關(guān)的WEE、c-Myc和CyclinD1等基因的表達(dá)。CLOCK/BMAL1能通過結(jié)合E-box上的Wee-1啟動子激活基因轉(zhuǎn)錄。而Cry蛋白的缺失能導(dǎo)致WEE-1表達(dá)升高，這可能是由于 Cry蛋白對 CLOCK/BMAL1異聚體阻遏的減弱。WEE-1是細(xì)胞周期激酶，在G2-M轉(zhuǎn)換中發(fā)揮重要作用。當(dāng)DNA復(fù)制或有DNA損傷時能激活WEE-1，使其細(xì)胞失活并使分裂停留在G2-M期。NPAS2與CLOCK的同源性和功能上的重疊，可能使其亦參與了這一細(xì)胞損傷修復(fù)過程。

Zhu等［26］采用全基因組芯片分析發(fā)現(xiàn)，目前已經(jīng)確定的NPAS2目的基因有16個，其中9個是目前已知與癌癥發(fā)展相關(guān)的基因，包括:CDKN2AIP(p16相關(guān)蛋白)、CDC25A(細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子)、ARHGAP29、POU4F2、GNAL、CX3CL1、KDELR1、THRA、ELF4。他們發(fā)現(xiàn)在無限增殖的"正常"乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A(在無胸腺小鼠中無致瘤性)內(nèi)，NPAS2基因的沉默對16個目的基因中的14個有重要影響。由于在接近人體正常細(xì)胞的MCF-10A細(xì)胞系中，NPAS2的沉默對一系列腫瘤基因的影響，更加證明 NPAS2可能是一個抑癌基因，NPAS2功能的缺失可能出現(xiàn)在腫瘤發(fā)展的早期過程中。

Kang等［27］通過提取不同時間段的腦組織檢測發(fā)現(xiàn)，在下午到夜晚時細(xì)胞中的DNA損傷修復(fù)活性最強，而午夜到清晨段最弱，提示DNA損傷的修復(fù)與生物鐘基因相關(guān)。Per1可通過調(diào)控細(xì)胞周期基因并與主要的DNA損傷激活的檢測點蛋白相互作用而起到抑制腫瘤的作用［28］，而NPAS2能夠?qū)er起調(diào)節(jié)作用，這從側(cè)面證實NPAS2對腫瘤的抑制調(diào)節(jié)作用。另有研究發(fā)現(xiàn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病的分子過程亦有NPAS2的參與。Kouri等［29］通過免疫組化等方法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜中各個生物鐘基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，ARNTL2和NPAS2是對人體免疫炎癥性疾病中影響最大的生物鐘基因。

總之，在腫瘤組織中普遍存在生物鐘基因的表達(dá)異常，生物鐘紊亂可能和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。生物鐘基因NPAS2同腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡及損傷修復(fù)關(guān)系密切，可能是潛在的抑癌基因。深入研究NPAS2以及其他生物鐘基因同腫瘤的關(guān)系，既能拓展人類對生物鐘基因的認(rèn)識，亦能豐富和完善腫瘤發(fā)生、發(fā)展機制，還可能為腫瘤的預(yù)防和治療提供新思路。

［1］王正榮．時間生物學(xué)［M］．北京:人民衛(wèi)生出版社，2008:5．

［2］Yi C，Mu L，de la Longrais IA，et al．The circadian gene NPAS2 is a novel prognostic biomarker for breast cancer［J］．Breast Cancer Res Treat，2010，120(3):663-669．

［3］Zhou YD，Barnard M，Tian H，et al．Molecular characterization of two mammalian bHLH-PAS domain proteins selectively expressed in the central nervous system［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1997，94(2):713-718．

［4］Nambu JR，Lewis JO，Wharton KA Jr，et al．The Drosophila single-minded gene encodes a helix-loop-helix protein that acts as a master regulator of CNSmidline development［J］．Cell，1991，67(6):1157-1167．

［5］Brunskill EW，Witte DP，Shreiner AB，et al．Characterization of npas3，a novel basic helix-loop-helix PASgene expressed in the developing mouse nervous system［J］．Mech Dev，1999，88(2):237-241．

［6］Shamloo M，Soriano L，von Schack D，et al．Npas4，a novel helixloop-helix PASdomain protein，is regulated in response to cerebral ischemia［J］．Eur JNeurosci，2006 24(10):2705-2720．

［7］Reick M，Garcia JA，Dudley C，et al．NPAS2:An Analog of Clock Operative in the Mammalian Forebrain［J］．Science，2001，293(5529):506-509．

［8］Wu X，Wiater MF，Ritter S．NPAS2 deletion impairs responses to restricted feeding but not to metabolic challenges［J］．Physiol Behav，2010，99(4):466-471．

［9］Kusanagi H，Hida A，Satoh K，et al．Expression profiles of 10 circadian clock genes in human peripheral blood mononuclear cells［J］．Neuroscience Research，2008，61(2):136-142．

［10］徐晨，錢睿哲，金惠銘．生物鐘基因與心血管疾?。跩］．中國病理生理雜志，2006，22(7):1450-1453．

［11］Englund A，Kovanen L，Saarikoski ST，et al．NPAS2 and PER2 are linked to risk factors of the metabolic syndrome［J］．JCircadian Rhythms，2009，(7):5．

［12］ Bruder-Nascimento A，Camargo CH，Sugizaki MF，et al．Clock genes and their genomic distributions in three species of salmonid fishes:Associations with genes regulating sexual maturation and cell cycling［J］．BMC Res Notes，2010，3(215):1-21．

［13］Kovanen L，Saarikoski ST，Aromaa A，et al．ARNTL(BMAL1)and NPAS2 gene variants contribute to fertility and seasonality［J］．PLoSOne，2010，5(4):e10007．

［14］Zhu Y，Leaderer D，Guss C，et al．Ala394Thr polymorphism in the clock gene NPAS2:a circadian modifier for the risk of non-Hodgkin＇s lymphoma［J］．Int JCancer，2007，120(2):432-435．

［15］Zhu Y，Stevens RG，Hoffman AE，et al．Testing the circadian gene hypothesis in prostate cancer:a population-based case-control study［J］．Cancer Res，2009，69(24):9315-9322．

［16］Takeda Y，Kang HS，Angers M，et al．Retinoic acid-related orphan receptorγdirectly regulates neuronal PAS domain protein 2 transcription in vivo［J］．Nucleic Acids Res，2011，39(11):4769-4782．

［17］Cho H，Zhao X，Hatori M，et al．Regulation of circadian behaviour and metabolism by REV-ERB-α and REV-ERB-β［J］．Nature，2012，485(7396):123-127．

［18］Uchida T，Sagami I，Shimizu T，et al．Effects of the bHLH domain on axial coordination of heme in the PAS-A domain of neuronal PAS domain protein 2(NPAS2):Conversion from His119/Cys170 coordination to His119/His171 coordination［J］．J Inorg Biochem，2012，108(2012):188-195．

［19］Dioum EM，Rutter J，Tuckerman JR，et al．NPAS2:A Gas-Responsive Transcription Factor［J］．Science，2002，298(5602):2385-2387．

［20］McNamara P，Seo SB，Rudic RD，et al．Regulation of CLOCK and MOP4 by nuclear hormone receptors in the vasculature:a humoral mechanism to reset a peripheral clock［J］．Cell，2001，105(7):877-889．

［21］敖翔，李淑晶，伍會?。芷诠?jié)律與腫瘤關(guān)系的分子機理［J］．中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2010，26(11):998-1002．

［22］Crumbley C，Wang Y，Kojetin DJ，et al．Characterization of the core mammalian clock component，NPAS2，as a REV-ERBalpha/RORalpha target gene［J］．J Biol Chem，2010，285(46):386-392．

［23］Bertolucci C，Cavallari N，Colognesi I，et al．Evidence for an O-verlapping Role of CLOCK and NPAS2 Transcription Factors in Liver Circadian Oscillators［J］．Mol Cell Biol，2008，28(9):3070-3075．

［24］Turek FW，Joshu C，Kohsaka A，et al．Obesity and metabolic syndrome in circadian clock mutant mice［J］．Science，2005，308(5724):1043-1045．

［25］Hoffman AE，Zheng T，Ba Y，et al．The circadian gene NPAS2，a putative tumor suppressor，is involved in DNA damage response［J］．Mol Cancer Res，2008，6(9):1461-1468．

［26］Yi CH，Zheng T，Leaderer D ，et al．Cancer-related transcriptional targets of the circadian gene NPAS2 identified by genome-wide ChIP-on-chip analysis［J］．Cancer Lett，2009，284(2):149-156．

［27］Kang TH，Reardon JT，Kemp M，et al．Circadian oscillation of nucleotide excision repair in mammalian brain［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2009，106(8):2864-2867．

［28］Gery S，Komatsu N，Baldjyan L，et al．The circadian gene Per1 plays an important role in cell growth and DNA damage control in human cancer cells［J］．Mol Cell，2006，22(3):375-382．

［29］Kouri VP，Olkkonen J，Kaivosoja E，et al．Circadian timekeeping is disturbed in rheumatoid arthritis at molecular level［J］．PLoS One，2013，8(1):1-10．