范存剛，周景儒，張慶俊，王棟梁

(北京大學(xué)人民醫(yī)院，北京100044)

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)易于獲得和擴(kuò)增，具有向神經(jīng)細(xì)胞分化的潛能，在細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有廣泛的應(yīng)用前景［1］。由于在短時(shí)間內(nèi)所能獲得的細(xì)胞數(shù)量往往是限制干細(xì)胞臨床應(yīng)用的瓶頸，故本研究擬在先前成功分離人胎肺MSCs研究的基礎(chǔ)上［2］，于2012年4月～2013年2月進(jìn)一步探討體外傳代擴(kuò)增和凍存復(fù)蘇對人胎肺MSCs形態(tài)、表型，特別是神經(jīng)分化潛能的影響，從而為快速獲得具有神經(jīng)分化潛能的MCSs提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料 DMEM、胎牛血清(FBS)、左旋谷胺酰胺、青鏈霉素、胰酶、胰島素—轉(zhuǎn)鐵蛋白—硒-A、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)均為美國Gibico公司產(chǎn)品。流式細(xì)胞學(xué)檢測抗體 CD13-PDE、CD14-FITC、CD29-PE、CD31-FITC、CD34-PE、CD38-PE、CD41a-PE、CD42b-PE、CD44-FITC、CD45-FITC、CD49d-FITC、CD61-FITC、CD90-FITC、CD106-PE、CD133-PE、CD166-PE、HLA-DR-PE、FITC-和 PE-標(biāo)記的 IgG1 同型對照均購于美國BD Pharmingen公司，CD105-FITC購于美國Ancell公司。純化的小鼠抗人HLA-ABC、兔抗小鼠FITC標(biāo)記的二抗、DMSO、丁羥茴醚(BHA)、氯化鉀、丙戊酸和氫化考地松、Triton X-100、抗生物素—生物素復(fù)合物、DAB和蘇木素均購于美國Sigma公司。弗斯扣林購于瑞士Alexis公司。小鼠抗人神經(jīng)元特異性烯醇化酶單克隆抗體(NSE)、兔抗人神經(jīng)微絲多克隆抗體(NF)、小鼠抗人Ⅲ型-β-微管蛋白單克隆抗體(TUJ1)、過氧化物酶偶聯(lián)的兔抗小鼠IgG和羊抗兔IgG均購自美國Chemicon公司。

1．2 方法

1．2．1 細(xì)胞分離和培養(yǎng) 無菌條件下采集人工流產(chǎn)胎兒的肺組織，以PBS洗滌后剪成1～2 mm3組織塊，以0．1% Ⅱ型膠原酶于37℃孵育40 min，PBS洗滌并收集細(xì)胞懸液，經(jīng)離心后再以5×104/mL的密度接種。次日換液并棄去未貼壁細(xì)胞，此后每3 d換液1次，待貼壁細(xì)胞達(dá)60% ～80%匯合后以0．20%胰酶/0．02%EDTA 液消化，按1∶3比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)［2，3］。

1．2．2 細(xì)胞凍存 收集對數(shù)生長期的細(xì)胞，以10%二甲基亞砜、20%FBS和70%LG-DMEM的凍存液重懸后置于程序降溫盒中，于－80℃冰箱過夜后轉(zhuǎn)入液氮長期貯存。

1．2．3 細(xì)胞復(fù)蘇 自液氮中取出細(xì)胞，放于37℃水浴箱中并緩慢震蕩，待冰晶即將完全溶解時(shí)吸取細(xì)胞懸液，洗滌、離心后重新接種。

1．2．4 細(xì)胞表型分析 收集對數(shù)生長期細(xì)胞，以PBS洗滌后1×106/50μL分裝于流式細(xì)胞管，向各管內(nèi)分別加入PE和FITC標(biāo)記的各種抗體及同型對照，于4℃避光孵育30 min，PBS洗滌和1%多聚甲醛固定后進(jìn)行流式細(xì)胞分析［2］。

1．2．5 神經(jīng)分化誘導(dǎo)方案 采用我們以往曾使用的誘導(dǎo)臍帶MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化類似的改良Woodbury神經(jīng)誘導(dǎo)方案［3，4］。將 MSCs以 5 × 104/mL接種于24孔板，達(dá)到60% ～80%匯合后，以含有20%FBS和10 ng/mL bFGF的DMEM預(yù)處理過夜，然后以含2%DMSO、200μmol/L BHA的DMEM誘導(dǎo)6 h，再向培養(yǎng)液中加入終濃度為25 mmol/L KCl、2 mmol/L丙戊酸、10 μmol/L弗斯扣林、1 μmol/L氫化考地松和1%胰島素—轉(zhuǎn)鐵蛋白—硒-A。

1．2．6 神經(jīng)表型分析 采用免疫組化法。神經(jīng)分化誘導(dǎo)結(jié)束后，依次以4%多聚甲醛固定15 min后以PBS沖洗，以 0．1%Triton X-100 4℃透膜20 min，以3%雙氧水中和內(nèi)源性過氧化物酶15 min，以含有10%FBS和5%牛血清白蛋白的PBS阻斷非特異性結(jié)合。然后，分別以一抗NSE(1∶200)、NF(1∶300)和 TUJ1(1∶200)于4℃孵育過夜，以PBS洗滌2次，以過氧化物酶偶聯(lián)的兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG二抗孵育45 min，以抗生物素—生物素復(fù)合物孵育15 min，再以 DAB顯色、蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。

1．2．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P≤0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 胎肺MSCs的形態(tài) 胎肺細(xì)胞原代培養(yǎng)24 h后可見均一的長梭形貼壁細(xì)胞，2周內(nèi)達(dá)到匯合。經(jīng)傳代擴(kuò)增和凍存復(fù)蘇后細(xì)胞仍保持均一長梭形，無明顯變化。見插頁Ⅰ圖1。

2．2 胎肺MSCs的免疫表型 流式細(xì)胞學(xué)分析表明，傳代擴(kuò)增和凍存復(fù)蘇后細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)情況未發(fā)生明顯變化，仍表達(dá) MSCs標(biāo)志物 CD13、CD29、CD44、CD105、CD90和 CD166，也表達(dá) HLA-ABC;但不表達(dá)造血細(xì)胞系標(biāo)志物 CD45、CD34、CD14、CD38、CD133和內(nèi)皮相關(guān)抗原 CD31，也不表達(dá) CD41a、CD42b、CD49d、CD106、CD61和 HLA-DR。

2．3 胎肺MSCs的神經(jīng)分化潛能 經(jīng)神經(jīng)分化誘導(dǎo)后，細(xì)胞胞體逐漸皺縮并伸出雙極或多極突起。隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長，細(xì)胞胞體皺縮為圓性或橢圓形，突起數(shù)目增多并延長，甚至伸出次級突起并相互交織成網(wǎng)狀。免疫組化分析顯示，全程誘導(dǎo)后NSE、NF-M和TUJ1陽性細(xì)胞率分別為55．2% ±4．1%、79．6% ±3．6% 和 71．9% ±4．5%，與凍存前的神經(jīng)分化陽性細(xì)胞率相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見插頁Ⅰ圖2。

3 討論

成人體內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的數(shù)量有限，使得中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病或損傷后難以通過內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞完成自身修復(fù)，故細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)［5］。基于神經(jīng)干細(xì)胞的上述不足［6］，以及胚胎干細(xì)胞純化困難和形成畸胎瘤的風(fēng)險(xiǎn)，使易于分離和擴(kuò)增的MSCs成為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病理想的備選細(xì)胞來源［7，8］。

新近有研究顯示，胎兒組織中不僅MSCs的含量高于成人組織，其細(xì)胞的增殖和分化能力也更強(qiáng)［9，10］。然而，自胎兒骨髓、肝、脾中分離 MSCs 往往需要以流式或磁珠分選去除造血細(xì)胞污染［11］，不僅技術(shù)較為復(fù)雜、耗時(shí)長，還可能影響細(xì)胞活力并增加細(xì)菌污染的風(fēng)險(xiǎn)。為此，我們對從胎肺組織中分離MSCs的可行性進(jìn)行探討，并成功培養(yǎng)出具有神經(jīng)分化潛能的胎肺MSCs［2］。鑒于在短時(shí)間內(nèi)所能獲得的細(xì)胞數(shù)量往往是限制干細(xì)胞臨床應(yīng)用的瓶頸，加之MSCs在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的廣泛應(yīng)用前景［12］，故我們進(jìn)一步對體外傳代擴(kuò)增和凍存復(fù)蘇的人胎肺MSCs的形態(tài)和表型，特別是向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的潛能進(jìn)行深入研究，從而為快速獲得具有向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化潛能的MCSs提供依據(jù)。

與付霞霏等［13］對大鼠骨髓 MCSs生物學(xué)性質(zhì)的研究結(jié)果相似，本研究所顯示長期傳代擴(kuò)增和凍存復(fù)蘇后人胎肺MSCs仍保持貼壁生長，呈長梭形，增殖能力和表面標(biāo)志物的表達(dá)未發(fā)生明顯變化。更重要的是，采用改良Woodbury神經(jīng)誘導(dǎo)方案能使凍存復(fù)蘇的人胎肺MSCs高效地分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞［3，4］，提示凍存后復(fù)蘇的胎肺 MSCs有望成為快速獲得神經(jīng)元樣細(xì)胞的種子細(xì)胞，以便用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。此外，本研究中的流式細(xì)胞學(xué)分析還揭示了胎肺MSCs的免疫分子特征，即胎肺MSCs表達(dá)HLA-ABC但不表達(dá)HLA-DR。由于異體移植排斥通常是HLA分子介導(dǎo)的，胎肺MSCs的上述免疫特征有助于降低異體移植的排斥反應(yīng)［14，15］，可能在異體細(xì)胞移植中有一定的應(yīng)用前景。

由此可見，胎肺MSCs易于分離和擴(kuò)增，并具有較強(qiáng)的增殖能力和向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的能力，且經(jīng)多次傳代擴(kuò)增和凍存復(fù)蘇后上述生物學(xué)性質(zhì)保持穩(wěn)定。加之胎肺MSCs的免疫原性較弱，故傳代擴(kuò)增和凍存復(fù)蘇的胎肺MSCs可作為快速獲得神經(jīng)元樣細(xì)胞的理想途徑，在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病中有一定的應(yīng)用前景。

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