丁志祥，錢高潮，張 琪

(南京中醫(yī)藥大學附屬常州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇常州213003)

動脈粥樣硬化(AS)是一種多病因的慢性炎癥性疾病，局部和全身的炎癥免疫反應在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，固有免疫和適應性免疫共同參與調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化病變。Toll樣受體(TLR)是一種介導天然免疫的跨膜信號傳遞受體，屬于模式識別受體，在細胞活化信號轉導中起重要作用［1］。近年來多項研究［2～4］顯示，TLR 介導的天然免疫及慢性炎癥與AS的發(fā)生發(fā)展密切相關。白細胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)是體內(nèi)重要的致炎因子，參與AS炎癥損傷。前期我們對中醫(yī)藥干預治療頸動脈粥樣硬化(CAS)進行了研究，以滋腎泄?jié)峄捣ㄑ兄频难}通顆粒治療CAS取得了一定療效［5，6］。2011年6月 ～2013年6月，本研究觀察血脈通顆粒對AS小鼠外周血單核細胞TLR4的表達和IL-6、TNF-α水平的影響，以探討血脈通顆粒防治AS的作用機制。

1 材料與方法

1．1 材料 遺傳背景為C57BL/6J的雄性apo E基因敲除(apo E－/－)小鼠 24只，體質(zhì)量 18～20 g，6周齡，購于南京生物醫(yī)藥研究院。血脈通顆粒為我院自制劑，主要成分為制首烏、水蛭、制黃精等7味中藥，制成顆粒配方約35 g(相當于生藥100 g)。RNA提取試劑(Trizol)購自Invitrogen公司，逆轉錄試劑盒(RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit)購自Fermentas公司，引物由上海生工公司合成，熒光定量PCR試劑盒(SYBR Green qPCR Master Mix)購自Roche公司，IL-6和 TNF-α試劑盒購自 R＆D公司，流式所用相關抗體、FACS Calibur流式細胞儀均購自美國BD公司，實時定量PCR儀購自美國ABI公司。

1．2 方法

1．2．1 造模與分組處理 將小鼠正常飼料適應性喂養(yǎng)1周后，飼以含脂肪21%、膽固醇0．15%的高脂飼料(60Co-γ射線輻照滅菌處理)，飼養(yǎng)條件為2級，室溫保持22～24℃，相對濕度50%，光照時間7:00 am～19:00 pm。小鼠高脂喂養(yǎng)13周后，隨機處死2只，分離胸主動脈進行油紅O染色(插頁Ⅰ圖3)，斑塊明顯可見，證實造模成功。將剩余22只小鼠隨機分為血脈通組和對照組，每組11只。血脈通組給予血脈通顆粒 3．808 mg/(g·d)［7］灌胃，對照組給予等量生理鹽水灌胃。

1．2．2 TLR4 mRNA檢測 采用RT-PCR法。將小鼠連續(xù)喂藥6周后處死，眼眶靜脈叢采血。分離外周血單核細胞，用 Trizol試劑提取總 RNA，溶于DEPC水中;紫外分光光度計測定OD260/OD280的比

1．2．3 TLR4熒光強度檢測 采用流式細胞術。取EDTA-K2抗凝的全血100μL，加入 CD11b-FITC和TLR4-PE單克隆抗體，震蕩混勻后避光孵育20 min;加入免洗溶血素，震蕩混勻10 min;加入PBS緩沖液500μL，混勻后上機檢測。結果分析應用Cell Quest軟件，根據(jù)前向散射光和側向散射光圈定單核細胞群，分析CD+11b/TLR4+細胞群，并計算平均熒光強度。

1．2．4 血漿IL-6、TNF-α 檢測 采用ELISA法檢測血漿IL-6和TNF-α水平，嚴格按照試劑盒說明書操作。450 nm讀取吸光度(A)值，以標準品濃度為橫坐標，A值為縱坐標，計算出標準曲線的回歸方程，將樣本的A值帶入方程式，計算出樣本濃度。

1．2．5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17．0統(tǒng)計軟件。計量資料以ˉx±s表示，組間比較采用t檢驗，相關性采用Pearson相關分析。P≤0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1 兩組外周血單核細胞TLR4 mRNA表達比較

血脈通組和對照組單核細胞TLR4 mRNA相對表達量分別為 0．22 ±0．07、0．31 ±0．09，P ＜0．05。

2．2 兩組外周血單核細胞表面TLR4熒光強度比較 血脈通組和對照組單核細胞表面TLR4熒光強度分別為25．45 ±8．30、34．04 ±7．30，P ＜0．05。

2．3 兩組血漿IL-6和TNF-α水平比較 血脈通組血漿IL-6和 TNF-α 水平分別為(10．86±4．41)、(36．94 ±9．46)pg/mL，對照組分別為(18．24 ±8．21)、(52．82 ± 13．78)pg/mL;兩組比較，P 均＜0．05。

2．4 IL-6、TNF-α 水平與單核細胞表面 TLR4熒光值在1．8 ～2．0，計算RNA 濃度。取總RNA 2 μL，逆轉錄合成cDNA。TLR4上游引物:5'-CACTGTTCTTCTCCTGCCTGAC-3'，下游引物:5'-TGGTTGAAGAAGGAATGTCATC-3'，擴增長度:196 bp。GAPDH 上游引物:5'-TGCCCCCATGTTTGTGAT-3'，下游引物:5'-GTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3'，擴增長度:244 bp。PCR反應體系:SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，cDNA 1 μL，加滅菌雙蒸水至20μL。PCR反應條件:95℃預變性5 min，95 ℃ 20 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s(45 個循環(huán))，循環(huán)后設置55～90℃，每隔0．3℃讀熒光值生成熔解曲線。每個樣本重復測定3次，以GAPDH為內(nèi)參，實驗結果采用相對定量法，計算各樣本ΔCt值(目的基因Ct值－內(nèi)參基因Ct值)，各樣本目的基因相對定量以2－ΔCt表示。強度的關系 小鼠血漿IL-6、TNF-α的水平與單核細胞表面TLR4熒光強度均呈正相關(r=4．86、0．51，P 均 ＜0．05)。

3 討論

TLR是一類重要的模式識別受體，特別是TLR4，作為新的炎癥信號傳遞門戶蛋白，能夠識別特定類型微生物的保守分子成分，從而激活信號轉導途徑，誘導炎癥反應;還可以促進抗原遞呈細胞的活化，啟動固有免疫反應，抵抗微生物感染。TLR4是免疫反應、慢性炎癥和脂代謝紊亂間的橋梁，激活TLR4可引起慢性炎癥反應，參與AS的形成［1］。

研究發(fā)現(xiàn)，TLR4的下游信號通路中存在一個重要的轉錄因子 NF-κB［8］。靜息狀態(tài)下，NF-κB 存在于胞質(zhì)中，以一種無活性的形式與其抑制性蛋白IκB結合。在脂多糖(LPS)刺激下，IκB被磷酸化并降解，NF-κB也由胞質(zhì)轉移至胞核，繼而啟動一系列炎癥相關基因的轉錄。LPS通過TLR4激活NF-κB，上調(diào)黏附分子ICAM-1、VCAM-1、內(nèi)皮細胞白細胞黏附分子的表達［9］。TLR4激活能夠增加單核細胞趨動蛋白1(MCP-1)和其他趨化因子表達，從而參與單核細胞聚集并啟動炎癥反應［1］。Yu等［10］研究發(fā)現(xiàn)，單核/巨噬細胞泡沫化過程中通過激活mTOR信號途徑上調(diào) TLR4表達，抑制 ox-LDL誘導的mTOR激活，可降低單核/巨噬細胞TLR4的表達，并減少泡沫細胞的形成。此外，TLR4激活還能誘導單核/巨噬細胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶2、9和組織蛋白酶表達增加，參與細胞外基質(zhì)的降解［11］。Xie等［12］發(fā)現(xiàn)，急性冠脈綜合征患者外周血TNF-α、MMP-9以及單核細胞表面TLR4的表達水平顯著高于對照組，可作為冠狀動脈粥樣硬化疾病易損斑塊的有效預警指標。

本研究結果顯示，血脈通顆粒治療后，AS小鼠外周血單核細胞TLR4的表達水平顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義;而且治療后血漿 IL-6和TNF-α水平顯著下降，與單核細胞表面TLR4熒光強度呈正相關。TLR4主要表達于單核/巨噬細胞表面，而單核/巨噬細胞是AS斑塊的主要構成細胞。單核/巨噬細胞可通過TLR4信號通路分泌多種炎癥因子(如 IL-6、TNF-α)，加重炎癥反應。同時，炎癥因子IL-6和TNF-α又可促進巨噬細胞表面LDL受體的合成及巨噬細胞對LDL攝取，加速脂質(zhì)的沉積，促進粥樣斑塊的形成［13］。

綜上所述，血脈通顆?？山档虯S小鼠外周血單核細胞TLR4的表達并減少炎癥因子IL-6和TNF-α的分泌，很可能是其治療AS的機理之一。

［1］Li H，Sun B．Toll-like receptor 4 in atherosclerosis［J］．JCell Mol Med，2007，11(1):88-95．

［2］Liu R，He Y，Li B，et al．Tenascin-C produced by oxidized LDL-stimulated macrophages increases foam cell formation through Tolllike receptor-4［J］．Mol Cells，2012，34(1):35-41．

［3］Lu Z，Li Y，Jin J，et al．Toll-like receptor 4 activation in microvascular endothelial cells triggers a robust inflammatory response and cross talk with mononuclear cells via interleukin-6［J］．Arterioscler Thromb Vasc Biol，2012，32(7):1696-1706．

［4］Scholtes VP，Versteeg D，de Vries JP，et al．Toll-like receptor 2 and 4 stimulation elicits an enhanced inflammatory response in human obese patients with atherosclerosis［J］．Clin Sci(Lond)，2011，121(5):205-214．

［5］張琪，張斌霞，蔣曉霞，等．血脈通顆粒治療頸動脈粥樣硬化的臨床研究［J］．南京中醫(yī)藥大學學報，2006，22(3):162-164．

［6］張斌霞，曾曉輝，張亦民．血脈通顆粒對頸動脈粥樣硬化的實驗研究［J］．陜西中醫(yī)，2007，28(9):1254-1256．

［7］徐叔云．藥理試驗方法學［M］．北京:人民衛(wèi)生出版社，2002:200．

［8］Kawai T，Akira S．Signaling to NF-kappaB by Toll-like receptors［J］．Trends Mol Med，2007，13(11):460-469．

［9］Yang J，Huang C，Yang J，et al．Statins attenuate high mobility group box-1 protein induced vascular endothelial activation:a key role for TLR4/NF-κB signaling pathway［J］．Mol Cell Biochem，2010，345(1-2):189-195．

［10］Yu M，Kang X，Xue H，et al．Toll-like receptor 4 is up-regulated by mTOR activation during THP-1 macrophage foam cells formation［J］．Acta Biochim Biophys Sin，2011，43(12):940-947．

［11］Paolillo R，Iovene MR，Romano Carratelli C，et al．Induction of VEGF and MMP-9 expression by toll-like receptor 2/4 in human endothelial cells infected with Chlamydia pneumoniae［J］．Int J Immunopathol Pharmacol，2012，25(2):377-386．

［12］Xie P，Cao YS，Su P，et al．Expression of toll-like receptor 4，tumor necrosis factor-alpha，matrix metalloproteinase-9 and effects of benazepril in patients with acute coronary syndromes［J］．Clin Med Insights Cardiol，2010，11(4):89-93．

［13］Gustafson B．Adipose tissue，inflammation and atherosclerosis［J］．JAtheroscler Thromb，2010，17(4):332-341．