張 矯，崔文靜，馬祥敏，王雯雯，王 欣

(天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，乳腺癌防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市腫瘤防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300060)

蛋白質(zhì)的反式剪接是一種翻譯后蛋白質(zhì)的成熟過程，即介于中間的多肽序列(內(nèi)含肽)自動(dòng)催化將其本身從蛋白質(zhì)前體中切除，伴隨形成肽鍵連接兩端的側(cè)翼序列(外顯肽)，形成成熟有功能的蛋白。這種反式剪接廣泛應(yīng)用于蛋白選擇性化學(xué)修飾、同位素探針標(biāo)記等生物技術(shù)領(lǐng)域［1］。目前，來源于Synechocystis sp．strain PCC6803的天然剪接內(nèi)含肽DnaE基因(Ssp DnaE)已得到廣泛應(yīng)用。然而，Ssp DnaE在哺乳動(dòng)物細(xì)胞37℃培養(yǎng)條件下剪接能力差，不能達(dá)到理想的實(shí)驗(yàn)研究要求［2，3］。2012 年 9月～2013年3月，我們應(yīng)用一種來源于 Nostoc punctiforme PCC73102的內(nèi)含肽DnaE基因(Npu DnaE)，并通過哺乳動(dòng)物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，證實(shí)其具有高效的蛋白剪接效率，為其研究與應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料 Phusion Hot StartⅡ DNA polymerase、Pierce BCA Protein Assay Kit蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Thermo公司;限制性內(nèi)切酶 EcoRI、BamHI購(gòu)自Fermentas公司;瓊脂糖凝膠回收試劑盒、In-fusion連接酶、Ecoli DH 5α菌株、質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自Takara公司;DMEM培養(yǎng)液購(gòu)自Neuron-biotech公司;胎牛血清(FBS)購(gòu)自蘭州民海生物工程有限公司;Anti GFP-Tag鼠源單克隆抗體及Anti c-myc-Tag鼠源單克隆抗體購(gòu)自天津三箭生物技術(shù)有限公司。293T細(xì)胞系、黃色熒光蛋白 Venus質(zhì)粒、pCDHCMV-MCS-EF1-Puro載體為天津市腫瘤醫(yī)院腫瘤細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室已有資源。Npu DnaE cDNA由GENEWIZ公司合成(合成時(shí)在N片段末尾加入myctag，方便剪接后的抗體檢測(cè))。

1．2 方法

1．2．1 引物設(shè)計(jì)方法 根據(jù) NCBI提供的 Npu DnaE、Venus基因信息設(shè)計(jì)引物，將Venus的N片段(1～154氨基酸)與Npu DnaE的N片段(1～102氨基酸)連接，構(gòu)成融合基因 Vn-NDn-myc，與pCDHCMV-MCS-EF1-Puro載體相連。引物設(shè)計(jì)為:①5'-ATTCTAGAGCTAGCGAATTCGCCACCATGGAGCTGTTCACCGGGGTG-3';②5'-GTCTCGTAGCTCAGGCAGGCGGTGATATAGACGTT-3';③5'-GATCCTTGCGGCCGCTTACAGGTCCTCCTCGCTG-3'。將 Npu DnaE的C片段(103～137氨基酸)與 Venus的 c片段(155～238氨基酸)連接，構(gòu)成融合基因NDc-Vc，與pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro載體相連。引物設(shè)計(jì)為:①5'-ATTCTAGAGCTAGCGAATTCGCCACCATGATCAAGATCGCCACCAG-3';②5'-CGTTCTTCTGCTTGTCCATGTTGCTGGCGATGAAGC-3';③5'-ATCCTTGCGGCCGCGGATCCTTAGATCCCGGCGGCGGTCA-3'。

根據(jù)In-fusion連接酶的使用原則，引物設(shè)計(jì)中上下游分別包含 pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro載體EcoRI、BamHI酶切位點(diǎn)前后各15個(gè)堿基的同源序列。上游引物包含Kozak序列，提高翻譯效率。同時(shí)，引物中重新帶入EcoRI、BamHI限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列，便于克隆的鑒定。引物由Invitrogen公司合成。

1．2．2 質(zhì)粒構(gòu)建方法 擴(kuò)增Vn-NDn-myc與NDc-Vc cDNA。使用Phusion Hot StartⅡ DNA polymerase進(jìn)行PCR反應(yīng)(98℃ 30 s，98℃ 10 s，50℃ 30 s，72 ℃ 30 s，2 個(gè)循環(huán);98 ℃ 10 s，63 ℃ 30 s，72 ℃30 s，18個(gè)循環(huán))，擴(kuò)增片段大小分別為830 bp和432 bp。瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收擴(kuò)增片段，并定量。

限制性內(nèi)切酶EcoRI、BamHI酶切pCDH-CMVMCS-EF1-Puro載體，方法同上，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收，并定量。將酶切的 pCDH-CMVMCS-EF1-Puro載體，分別與擴(kuò)增的 Vn-NDn-myc、NDc-Vc cDNA連接，比例為1∶3～4。In-fusion連接酶2．5～3μL，加入H2O建立15μL連接體系，室溫連接30 min后，將連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化 Ecoli DH5α，挑取單個(gè)克隆接種在含氨芐霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩過夜。取菌液提取質(zhì)粒，EcoRI、BamHI酶切鑒定。鑒定產(chǎn)物經(jīng)0．8%瓊脂糖凝膠電泳，并在凝膠成像分析儀上成像。構(gòu)建的質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定后送六合華大基因公司測(cè)序，經(jīng)測(cè)序比對(duì)正確后，再大量擴(kuò)增。

1．2．3 轉(zhuǎn)染方法 采用Ca2+法。轉(zhuǎn)染前1 d鋪種293T細(xì)胞于6孔板中，每孔種40×104個(gè)細(xì)胞，加入2 mL培養(yǎng)液(DMEM+10%FBS+1%PS)，待次日細(xì)胞匯合度達(dá)到50%。轉(zhuǎn)染時(shí)取4μg構(gòu)建的質(zhì)粒，加入2 mol/L CaCl214 μL、2 ×HBS 114 μL、H2O 100μL，混勻后加入細(xì)胞培養(yǎng)液中。5～7 h后更換2 mL新鮮培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h后熒光顯微鏡下觀察。

1．2．4 蛋白檢測(cè)方法 采用Western blot法。轉(zhuǎn)染48 h后，6孔板中每孔加入200μL細(xì)胞裂解液(lysis Buffer)裂解293T細(xì)胞，收集蛋白。酶標(biāo)儀檢測(cè)蛋白濃度，各樣品分別取30μg上樣電泳，轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜(NC)過夜。第2天將NC膜轉(zhuǎn)移至封閉液(5%Milk)中，搖床封閉1 h，膜分別孵育Anti GFPTaq和Anti c-Myc-Tag鼠源的單克隆一抗1 h，TBS-T沖洗，孵育熒光標(biāo)記的鼠源二抗1 h，TBS-T沖洗，儀器掃描，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2．1 質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果 雖然出現(xiàn)非特異的條帶，但可見明亮擴(kuò)增的目的條帶，位置、大小和設(shè)計(jì)一致，且與非特異條帶分離，不影響切膠回收及后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將構(gòu)建的 Vn-NDn-myc質(zhì)粒用 EcoRI、NotI酶切鑒定，可切出817 bp的條帶;NDc-Vc質(zhì)粒用 NheI、BamHI酶切鑒定，可切出398 bp的條帶，與擴(kuò)增的Vn-NDn-myc、NDc-Vc cDNA，pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro(EcoRI、BamHI酶切回收后，7 362 bp)載體相對(duì)應(yīng)(圖1)。測(cè)序結(jié)果經(jīng)pubmed Blast比對(duì)后，證實(shí)插入pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro載體的目的基因正確無誤。

圖1 cDNA擴(kuò)增及構(gòu)建質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳鑒定

2．2 轉(zhuǎn)染結(jié)果 Npu DnaE在102與103位氨基酸位點(diǎn)斷開形成N片段與C片段，這兩部分單獨(dú)存在時(shí)沒有活性，但當(dāng)斷裂的N和C片段混合時(shí)，兩者相互識(shí)別，重建催化活性中心，介導(dǎo)蛋白質(zhì)反式剪接，連接兩端的Venus片段，使得熒光蛋白的兩個(gè)片段在空間上互相靠近互補(bǔ)，重新構(gòu)建成完整、具有活性的熒光蛋白分子，并在該熒光蛋白的激發(fā)光激發(fā)下，發(fā)射熒光(插頁Ⅰ圖4A)。轉(zhuǎn)染48 h后觀察熒光，發(fā)現(xiàn)與293T Wild Type及分別轉(zhuǎn)染 Vn-NDnmyc、NDc-Vc質(zhì)粒組相比，共轉(zhuǎn)染 Vn-NDn-myc、NDc-Vc質(zhì)粒細(xì)胞出現(xiàn)熒光，且熒光強(qiáng)度與轉(zhuǎn)染Venus wild type質(zhì)粒相比并無差異，證明Npu DnaE內(nèi)含肽能夠在293T細(xì)胞中發(fā)揮作用，而且具有很高的剪接效率(插頁Ⅰ圖4B)。

2．3 蛋白檢測(cè)結(jié)果 anti c-myc抗體檢測(cè)到Vn-NDn-myc融合蛋白及發(fā)生剪接后脫落的NDn-myc蛋白，anti GFP抗體檢測(cè)到NDc-Vc融合蛋白及Npu DnaE內(nèi)含肽剪接后形成的完整熒光蛋白，且蛋白大小與實(shí)際一致，剪接后形成的完整熒光蛋白大小與Venus wild type也高度一致，進(jìn)一步證明了 Npu DnaE內(nèi)含肽能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)揮作用，并且具有高效的目的蛋白形成率(圖2)。

3 討論

圖2 Western blot檢測(cè)蛋白結(jié)果

蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾，如磷酸化、糖基化、脂化、泛素化等可以通過多種方式完成，包括生物整合、化學(xué)合成、酶調(diào)反應(yīng)及各種蛋白質(zhì)連接方法［4～6］。在各種蛋白質(zhì)連接方法中，蛋白質(zhì)的反式剪接具有重要地位，不僅應(yīng)用于制作化學(xué)探針、重組蛋白質(zhì)片段、標(biāo)記目的蛋白的核心區(qū)域，為形成大分子量的蛋白質(zhì)提供強(qiáng)大的生物學(xué)技術(shù);在細(xì)胞內(nèi)形成環(huán)狀肽，提高肽的穩(wěn)定性及生物學(xué)活性，應(yīng)用于醫(yī)藥化學(xué)領(lǐng)域;還能使建立高通量篩選基因編碼庫成為可能［7，8］;基于剪接內(nèi)含肽活性研制的生物傳感器也得到應(yīng)用，如鑒別線粒體蛋白質(zhì)［9］、監(jiān)測(cè)Caspase蛋白水解酶活性［10］。

研究顯示，雖然念珠藻DNA聚合酶Ⅲ內(nèi)含肽-Npu DnaE與集胞藻DNA聚合酶Ⅲ內(nèi)含肽-Ssp DnaE蛋白序列具有同源性，即N片段67%(68/102)，C片段53%(19/36)，但Npu DnaE剪接效率是 Ssp DnaE的33～170倍，連接產(chǎn)物形成率為55% ～90%(依據(jù)外顯肽序列的不同)［11］;在哺乳動(dòng)物細(xì)胞37℃培養(yǎng)條件下，Ssp DnaE剪接效率、連接產(chǎn)物形成率均下降，Npu DnaE則不受影響，原因在于Npu DnaE內(nèi)含肽活性更為穩(wěn)定，能夠適應(yīng)兩端外顯肽末端不同的氨基酸殘基序列，尤其是當(dāng)外顯肽末端為芳香族、疏水性氨基酸殘基序列時(shí)，Npu DnaE內(nèi)含肽具有更高的剪接活性［12，13］。相比于人工合成的剪接內(nèi)含肽需經(jīng)過變性—復(fù)性過程才能重組蛋白質(zhì)的活性，且對(duì)蛋白質(zhì)重新折疊和發(fā)揮剪接功能的環(huán)境要求嚴(yán)格，Npu DnaE內(nèi)含肽的剪接功能不需要任何外部力量及輔助因子的影響，同源的Npu DnaE內(nèi)含肽N片段與C片段即使在低濃度的條件下也能發(fā)生剪接反應(yīng)，進(jìn)一步提高了其在分子生物學(xué)中的應(yīng)用前景［13～15］。

本實(shí)驗(yàn)利用雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)(BiFC)將熒光亮度強(qiáng)、化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、成熟時(shí)間短、便于及時(shí)觀察的熒光蛋白Venus片段分別連接到具有相互作用的Npu DnaE內(nèi)含肽片段上，構(gòu)建質(zhì)粒。在細(xì)胞內(nèi)共表達(dá)這兩個(gè)融合蛋白時(shí)，由于Npu DnaE內(nèi)含肽N片段與C片段的相互作用，熒光蛋白Venus的兩個(gè)片段在空間上互相靠近、識(shí)別，重新構(gòu)建成活性熒光蛋白分子，并發(fā)射熒光，通過檢測(cè)功能蛋白質(zhì)Venus的活性來判斷目標(biāo)蛋白質(zhì)Npu DnaE內(nèi)含肽的相互作用，證明Npu DnaE內(nèi)含肽能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞37℃培養(yǎng)條件下發(fā)揮反式剪接的生物學(xué)功能，剪接活性不受溫度升高的影響，并且具有高效的剪接效率及功能目的蛋白的形成率，為臨床及科研實(shí)際應(yīng)用提供有力依據(jù)。

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