黃東輝，李 菁，辛 燕，郭征東，夏作理

(1泰山醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院，山東泰安271000;2泰安市中醫(yī)二院;3濟(jì)南市中醫(yī)院;4泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

糖尿病性周圍神經(jīng)病變(DPN)是糖尿病常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥之一。糖尿病患者中DPN的發(fā)病率可高達(dá)60% ～90%，其中30% ～40%的患者無(wú)癥狀［1］。DPN發(fā)病與多種因素有關(guān)，如神經(jīng)纖維蛋白糖基化和維生素缺乏、神經(jīng)滋養(yǎng)血管損傷、神經(jīng)生長(zhǎng)因子減少等［2，3］。泰山白花丹參是丹參的變種，是山東特有珍稀瀕危藥用植物，主產(chǎn)于泰山，該中藥材已經(jīng)廣泛用于防治冠心病、腦血管病和外周血管的多種病變，具有較好的降糖、調(diào)脂、改善血流變的作用。2012年9月～2013年2月，我們對(duì)白花丹參水提物對(duì)糖尿病大鼠神經(jīng)病變干預(yù)作用進(jìn)行了相關(guān)研究?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性Wistar大鼠90只(山東魯抗公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體質(zhì)量200～220 g。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，禁食12 h，自由飲水，隨機(jī)選出12只作為空白對(duì)照組，標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)。余78只制備糖尿病模型，予以高脂飼料飼養(yǎng)。高脂飼料配方:2．5%膽固醇，10%豬油，20%蔗糖，膽酸鹽1%，常規(guī)飼料66．5%。

1．2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 白花丹參均產(chǎn)自萊蕪苗山白花丹參種植基地，經(jīng)泰山醫(yī)學(xué)院生藥教研室蘇延友教授鑒定為泰山白花丹參。白花丹參水溶性提取物制備:稱取白花丹參根適量，切片后加蒸餾水浸泡2 h，加熱煮沸，開(kāi)始用強(qiáng)火，沸騰后改用文火，保持微沸30 min，攪拌、趁熱過(guò)濾;藥渣再加蒸餾水同法煮沸后30 min，濾過(guò);合并濾液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，最后用蒸餾水稀釋至所需濃度灌封，4℃保存?zhèn)溆?。鏈脲佐菌?STZ)購(gòu)自北京博愛(ài)科貿(mào)有限公司;甲鈷銨(批號(hào):20120912)購(gòu)自石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)股份有限公司;血清神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)試劑盒(批號(hào):12090319)購(gòu)自上海森雄生物制品有限公司;cGMP試劑盒(批號(hào):20120917)和cAMP試劑盒(批號(hào):20121011)均購(gòu)自長(zhǎng)沙力生科貿(mào)有限公司實(shí)驗(yàn)試劑耗材部。血糖儀為美國(guó)羅氏公司產(chǎn)品。

1．3 方法

1．3．1 糖尿病模型的制備及分組 78只大鼠高糖高脂飼料喂養(yǎng)1個(gè)月后，用0．1 mol/L(pH 4．5)的枸櫞酸鈉緩沖液新鮮配成10 g/L的STZ溶液，按照40 mg/kg一次性腹腔注射STZ，注藥后72 h尾尖取血測(cè)血糖，將血糖≥16．7 mmol/L者確定為糖尿病模型［4］，共60只進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。將60只造模成功大鼠隨機(jī)分為5組:模型組，白花丹參小劑量組［15 g/(kg·d)］，白花丹參中劑量組［30 g/(kg·d)］，白花丹參大劑量組［45 g/(kg·d)］，甲鈷胺組［17．5 mg/(kg·d)］。各組大鼠均給予每天灌胃給藥1次，灌胃容積均為10 mL/kg，模型組給予等量的生理鹽水灌胃;空白對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)的同時(shí)，給予等量的生理鹽水灌胃，連續(xù)12周。

1．3．2 觀察方法與指標(biāo)測(cè)定

1．3．2．1 坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度測(cè)定 給藥第6周末及第12周末測(cè)定坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度(MNCV)測(cè)定:將10%水合氯醛按350 mg/kg標(biāo)準(zhǔn)腹腔注射麻醉，麻醉后俯臥位固定。刺激針電極置于坐骨切跡處的坐骨神經(jīng)傳出部位，于踝關(guān)節(jié)坐骨神經(jīng)經(jīng)過(guò)部位，參考電極在刺激電極與記錄電極之間距離記錄電極1 cm處。用單脈沖方波刺激，波寬0．1 ms，刺激強(qiáng)度1．5倍閾值。每?jī)蓚€(gè)刺激之間間隔5 s以上。嚴(yán)格控制室溫(20±5)℃，保持動(dòng)物體溫37℃。計(jì)算機(jī)記錄從刺激神經(jīng)開(kāi)始到遠(yuǎn)端肌肉出現(xiàn)動(dòng)作電位的時(shí)間，即潛伏期。重復(fù)測(cè)定7～10次，計(jì)算平均值。將動(dòng)物后足以自然肢體狀態(tài)與脊柱成45°向斜后方拉直，沿動(dòng)物體表準(zhǔn)確測(cè)定刺激電極到記錄電極之間的距離。MNCV(m/s)=刺激電極與記錄電極間的距離/潛伏期，計(jì)算坐骨結(jié)節(jié)到踝關(guān)節(jié)處的 MNCV。感覺(jué)神經(jīng)傳導(dǎo)速度(SNCV)測(cè)定:刺激電極與記錄電極的位置與測(cè)定MNCV時(shí)相反。SNCV的計(jì)算方法同上。每6周測(cè)定1次大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度(MNCV和SNCV)。

1．3．2．2 血清NGF測(cè)定 給藥結(jié)束后(12周末)，各組大鼠股靜脈采血，分離血清后采用ELISA法測(cè)定大鼠血清NGF含量，按照試劑盒說(shuō)明操作。

1．3．2．3 坐骨神經(jīng)內(nèi) cAMP、cGMP含量測(cè)定 測(cè)定MNCV和SNCV后，分離大鼠雙下肢肌肉組織，取出兩側(cè)坐骨神經(jīng)組織，冰浴環(huán)境內(nèi)，按照每50 mg神經(jīng)加2 mL 50 mg醋酸緩沖液(pH 4．75)勻漿，勻漿液60℃水浴中吹干，－20℃冰箱保存。cGMP和cAMP均采用放射免疫法測(cè)定，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作。

1．3．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以ˉx±s表示，采用t檢驗(yàn)，3組間比較采用方差分析，多個(gè)樣本均數(shù)之間的兩兩比較采用q檢驗(yàn)，各指標(biāo)間的相關(guān)分析用Pearson相關(guān)分析法。P≤0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 各組大鼠空腹血糖(FPG)、NGF、cAMP、cGMP水平比較 給藥第12周末，白花丹參對(duì)各組大鼠FPG、NGF、cAMP、cGMP 的影響見(jiàn)表1。

2．2 各組大鼠SNCV和MNCV比較 給藥第6周末及第12周末各組大鼠SNCV和MNCV比較見(jiàn)表2。

3 討論

DPN可累及周圍神經(jīng)、植物神經(jīng)和中樞神經(jīng)，其中以對(duì)稱性的周圍神經(jīng)病變最為多見(jiàn)和典型，是糖尿病患者致殘的主要原因，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。其病理變性首先累及感覺(jué)神經(jīng)，可見(jiàn)神經(jīng)纖維發(fā)生節(jié)段性髓鞘脫失，嚴(yán)重時(shí)可伴有軸索變性，有些纖維出現(xiàn)髓鞘再生現(xiàn)象。坐骨神經(jīng)、正中神經(jīng)、腓神經(jīng)、脛后神經(jīng)、股神經(jīng)等周圍神經(jīng)組織病理均有類似的表現(xiàn)。STZ誘導(dǎo)大鼠模型早期的神經(jīng)功能和生化異常變化與人類DPN發(fā)生相似，在造模2周后就可以明顯出現(xiàn)［5，6］。DPN的發(fā)生和發(fā)展是糖代謝異常和神經(jīng)微循環(huán)障礙共同參與的結(jié)果［7，8］，與氧化應(yīng)激［9，10］、NGF 缺乏也有一定關(guān)系［11］，NGF 可促進(jìn)神經(jīng)中血管的再生和血管活性因子的產(chǎn)生［12］。

表1 給藥第12周末各組大鼠FPG、NGF、cAMP、cGMP水平比較(ˉx±s)

表2 給藥第6周末及第12周末各組大鼠SNCV和MNCV比較(m/s，ˉx±s)

目前的治療方式主要是控制血糖，改善局部微循環(huán)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)。甲鈷胺是維生素B12的衍生物，是目前最常用的治療DPN的藥物，可參與神經(jīng)纖維蛋白的甲基轉(zhuǎn)換［13］，通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)組織內(nèi)的核酸、蛋白質(zhì)及卵磷脂的合成，促進(jìn)神經(jīng)髓鞘形成和軸突再生，提高坐骨神經(jīng)中cAMP及cGMP的含量，從而修復(fù)受損的神經(jīng)細(xì)胞，提高Na-K-ATP酶的活性，提高神經(jīng)血管的通透性，改善神經(jīng)內(nèi)膜缺氧，改善神經(jīng)傳導(dǎo)速度。

本研究顯示，經(jīng)過(guò)12周的白花丹參水溶物干預(yù)治療后，白花丹參各劑量組大鼠的SNCV和MNCV均有不同程度改善，其中以高劑量白花丹參組改善最為明顯，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系;大劑量組效果優(yōu)于甲鈷胺組，原因除了白花丹在參可以明顯降低血糖外，與其尚可以有效提高 NGF、cAMP含量，降低cGMP含量有關(guān)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明白花丹參在預(yù)防、治療糖尿病神經(jīng)病變方面有較好的應(yīng)用價(jià)值，可在藥物開(kāi)發(fā)方面進(jìn)一步推廣使用。

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