馬天翔，肖建華

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

犬瘟熱（CD）是由犬瘟熱病毒（CDV）引起的一種高發(fā)傳染病，宿主范圍包括大部分食肉目動物[1]。CDV可以感染不同器官和組織的上皮細胞、間質(zhì)細胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細胞，與造血中樞神經(jīng)系統(tǒng)的持續(xù)感染有關(guān)。常規(guī)免疫接種在正常情況下是一種高度有效的預(yù)干細胞，引發(fā)全身型或神經(jīng)型的臨床過程，并在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和淋巴組織中形成持續(xù)感染，免疫抑制和脫髓鞘性腦脊髓炎是代表性的病癥。據(jù)報道，犬瘟熱在法國、德國、美國、日本和芬蘭等常規(guī)免疫執(zhí)行很好的國家仍然會發(fā)生流行，表明預(yù)防接種過的犬也可能發(fā)病，而其發(fā)病機制亦可能存在新的變化[2-4]。犬瘟熱作為犬的重要傳染病，可表現(xiàn)為多種復(fù)雜癥狀，由于其典型的雙相熱型在近期的臨床病例中并不常見，致使臨床確診較為困難。因此，實驗室診斷CDV是非常必要的。

1 犬瘟熱的診斷

1.1 病毒的分離與鑒定

CDV分離培養(yǎng)是確診該病的最根本方法，但工作量較大，且CDV對外界環(huán)境的抵抗力很弱，其脂質(zhì)囊膜結(jié)構(gòu)較脆弱，易被光和熱滅活，致使病毒分離成功率較低。分離CDV用的組織細胞有原代細胞及傳代細胞系兩大類。原代培養(yǎng)細胞有犬或貂的肺和腹腔巨噬細胞、腎細胞等[5]。最有效的方法是用幼犬或雪貂的肺臟巨噬細胞進行培養(yǎng)。分離CDV的傳代細胞系有犬腎細胞系（MDCK）、狗腎細胞系（DK）、非洲綠猴腎細胞系（Vero）等多種細胞系。 用Vero 細胞分離培養(yǎng)CDV被認為是首選細胞。近年來用來源于犬惡性組織細胞增多癥的組織細胞建立的細胞系CCT 細胞培養(yǎng)CDV獲得了成功[6]。

分離后的病毒通常可以結(jié)合電鏡檢查、動物回歸試驗以及病毒特異性抗原和特異性核酸診斷試驗等方法對病毒進行進一步的鑒定。在進行動物回歸試驗時，各種接種途徑均可使雪貂、犬和水貂發(fā)生具有臨床癥狀的感染，電鏡觀察是檢查、確定CDV感染最簡便快速的方法。遇秀玲等報道，采用電鏡技術(shù)對CDV93039 株和CDVMD—77 株在體外培養(yǎng)細胞中的增殖過程和所致病變特點進行了觀察，發(fā)現(xiàn)CDV93039 株少見長絲狀核衣殼聚集及典型的胞膜上出芽病毒粒子，包涵體以電子致密小體為主：CDVMD—77 株可見成堆存在的核衣殼結(jié)構(gòu)，胞膜上出芽增殖明顯可見，包涵體以核衣殼結(jié)構(gòu)聚集為主，后期也有電子致密小體[7]。房紅瑩等對臨床診斷為犬瘟熱的14 例病犬，取腦組織，運用細胞培養(yǎng)、合胞體檢查、包涵體檢查、免疫熒光試驗、電鏡觀察5種檢測方法，就犬瘟熱的微生物學(xué)診斷進行了系統(tǒng)的研究，結(jié)果表明，建立的改良離子捕獲電鏡法用于檢測犬腦勻漿和犬腦接種細胞培養(yǎng)物，與離子捕獲電鏡法、免疫電鏡法及直接電鏡法相比效果更為理想[8]。但采用電鏡對病毒進行鑒定時只能觀察病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)，很難與同科的病毒相區(qū)別。傳統(tǒng)的病毒分離鑒定技術(shù)的結(jié)果準確、可靠，但分離過程繁瑣、時間長，并且在病后期由于中和抗體的出現(xiàn)很難分離到病毒。

1.2 免疫學(xué)檢測方法

1.2.1 熒光抗體技術(shù)

楊百亮等建立了用于檢測犬瘟熱病毒的間接熒光抗體染色法，試驗確定了1∶80 稀釋的抗犬瘟熱單克隆抗體和32倍稀釋的熒光素標記羊抗鼠IgG為適宜的工作濃度，對自然感染犬的眼分泌物、鼻汁、糞便和血涂片CDV檢出率分別為21%、14%、15%和76%，說明熒光抗體技術(shù)是一種簡便、快速、特異的檢測犬瘟熱的方法[9]。岳妙姝將犬瘟熱病毒純化后免疫雌性BALB/c 小鼠，取其脾細胞與SP2/0 骨髓瘤細胞進行融合，經(jīng)克隆和間接ELISA篩選，獲得6株穩(wěn)定分泌抗犬瘟熱病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞株，采用G蛋白親和層析柱對腹水進行純化，將純化后的單抗腹水用異硫氰酸熒光素（FITC）標記制備熒光抗體，并對該熒光抗體進行鑒定，吸收試驗、阻斷試驗和與犬細小病毒（CPV）、輪狀病毒（RV）及犬腺病毒（CAV）的交叉試驗表明，所制備的熒光抗體具有特異性強、敏感性高的特點；應(yīng)用該技術(shù)制備的單克隆抗體對感染CDV的細胞進行了檢測，結(jié)果表明，該單克隆抗體顯示了對CDV的高特異性，用該抗體制備的熒光抗體在對CDV的實驗室診斷中具有快速和特異性高的特點[10]。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附法

李娜建立了間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（間接ELISA）的診斷方法以檢測CDV血清抗體水平，通過測定CDV抗原包被的最佳濃度、血清的最佳稀釋度、酶標HRP 二抗的最適工作濃度等優(yōu)化試驗，選擇間接ELISA最佳的反應(yīng)條件，試驗結(jié)果表明，抗原的最佳包被濃度為0.525 μg·100 μL-1，最適血清稀釋度為1∶40，酶標HRP 二抗的最適工作濃度為 1∶2000[11]。

1.2.3 瓊脂擴散試驗

任文陟等用CD 雞胚成纖維細胞弱毒疫苗免疫綿羊制備瓊脂擴散抗體，建立了瓊脂擴散試驗方法[12]。雖然只能粗略地對抗體進行測定，靈敏性較差，但不需要特殊儀器，操作簡單，適宜在基層臨床中推廣。

1.2.4 膠體金試紙條法

膠體金試紙條法是基于單克隆抗體建立的診斷技術(shù)。An 等利用獲得的2 株單克隆抗體建立了膠體金試紙條診斷技術(shù)，并用巢式PCR 進行比較，雖然敏感性（89.7%和85.7%）和特異性（94.6%和100%）略低，但其使用方便，造價低廉，所以更容易在臨床上推廣[13]。

1.3 分子生物學(xué)技術(shù)

反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR）診斷法比傳統(tǒng)診斷法具有更高的敏感性和特異性，尤其在犬瘟熱發(fā)病早期，機體尚未產(chǎn)生免疫應(yīng)答時，RTPCR診斷法便能夠作出早期診斷，有利于及早地確診經(jīng)濟動物（貂、狐貍和貉子）及野生保護動物（獅、虎和豹）等是否感染了犬瘟熱病毒，以便采取有效的防治措施，這對降低經(jīng)濟損失、保護生態(tài)平衡具有重要意義[14]。鞠會艷等針對犬瘟熱病毒N和H蛋白的核苷酸序列分別設(shè)計引物，利用RT-PCR技術(shù)檢測了來自不同地區(qū)的水貂、狐貍、貉子和老虎病料中犬瘟熱病毒的感染情況，研究結(jié)果表明，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)對病料中犬瘟熱病毒的檢測具有科學(xué)性和可信度[15]。Stanton 等對半巢式PCR 方法和免疫熒光法、病理組織學(xué)方法及免疫組化法進行比較，發(fā)現(xiàn)半巢式PCR 方法更適于發(fā)病后的檢測，能夠在區(qū)別疫苗株和流行株[16]。

1.4 包涵體檢查

包涵體主要存在于膀胱、膽管、膽囊和腎盂上皮細胞內(nèi)，大多存在于胞漿內(nèi)，一般呈現(xiàn)圓形或橢圓形。但CDV形成的包涵體難以與狂犬病病毒等所形成的包涵體及類似物區(qū)分，因此確診犬瘟熱需要與其他方法相結(jié)合。

2 犬瘟熱的預(yù)防

2.1 定期接種疫苗

幼犬首免在45～50日齡進行，每隔21～28 d 加強免疫1次，連續(xù)免疫3次（如犬首免時間在3月齡以上，可按上述程序連續(xù)免疫2 次），以后每年加強免疫1次。疫苗目前主要用進口的犬二聯(lián)苗、五聯(lián)苗、六聯(lián)苗或七聯(lián)苗。免疫時同時注射免疫增強劑（胸腺肽等），免疫效果會更好。如犬場曾發(fā)生過犬瘟熱、細小病毒病等疫情，建議在幼犬出生后28日齡免疫1次犬小二聯(lián)苗（犬瘟熱和細小病毒二聯(lián)疫苗）。

2.2 加強飼養(yǎng)管理

每周1 次對犬舍以3%燒堿溶液或10%福爾馬林消毒。定時定量飼喂，并給予充足的飲水，圈舍要通風(fēng)干燥，同時每天進行適量的戶外運動，增強機體抵抗力。發(fā)現(xiàn)病犬或疑似病犬應(yīng)及時隔離、治療，預(yù)防繼發(fā)感染，對無治療價值的進行撲殺或?qū)嵤┌矘匪?，實行無害化處理。各養(yǎng)殖場盡量做到自繁自養(yǎng)，防止外來疫源傳入。

3 小 結(jié)

熒光抗體技術(shù)、ELISA、膠體金試紙條法與傳統(tǒng)的病毒分離培養(yǎng)相比，具有敏感、特異、準確等優(yōu)點。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，國內(nèi)外相繼建立起CDV核酸雜交和RT-PCR 檢測法，其方法比免疫學(xué)檢測法具有更高的敏感性和特異性，尤其在CDV感染早期，尚未產(chǎn)生免疫應(yīng)答的情況下RT-PCR 檢測法便能夠作出早期診斷。但犬瘟熱的預(yù)防也不容忽視，只有定期接種疫苗、加強飼養(yǎng)管理，才能控制犬瘟熱的發(fā)生。

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