杜宗緒

（濰坊職業(yè)學(xué)院，山東濰坊261031）

牛奶營養(yǎng)豐富，是大自然賦予人類最有益健康的食品之一，但含有抗生素殘留的牛奶及其制品會嚴(yán)重為害飲用者的身體健康。此外，抗生素殘留會影響牛奶品質(zhì)，造成乳制品行業(yè)的重大經(jīng)濟(jì)損失，還可能被排泄造成環(huán)境污染。膠體金免疫層析技術(shù)在食品安全性檢測上表現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢，在測定牛奶中抗生素殘留上應(yīng)用前景廣闊。

1 膠體金免疫層析技術(shù)（ColloidalGold ImmunochromatographyAssay，GICA）

20世紀(jì)80—90年代，在酶聯(lián)免疫吸附試驗、乳膠凝集試驗、單克隆抗體技術(shù)、膠體金免疫技術(shù)和新材料技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展了新型體外診斷技術(shù)膠體金免疫層析技術(shù)[1]。其原理是以硝酸纖維素膜為載體，利用微孔膜的毛細(xì)管作用，滴加在膜條一端的液體慢慢向另一端滲移，通過抗原抗體結(jié)合，并利用膠體金呈現(xiàn)顏色（紅色）反應(yīng)，檢測抗原/抗體[2]。

用膠體金免疫層析技術(shù)檢測牛奶中抗生素的殘留，即牛奶中的抗生素在流動過程中與膠體金標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合，抑制了抗體和硝酸纖維素膜檢測線（T線）上的抗生素-載體蛋白偶聯(lián)物的結(jié)合，從而導(dǎo)致檢測線顏色深淺的變化。當(dāng)樣本中沒有抗生素或其濃度低于試紙條檢測限時，T線顯色；當(dāng)樣本中的抗生素濃度等于或高于檢測限時，T線不顯色；而無論樣本中是否含有抗生素，質(zhì)控線（C線）都會顯色，以示檢測有效。

2 膠體金免疫層析技術(shù)在牛奶抗生素檢測中的應(yīng)用

牛奶中的抗生素主要有7類，即：β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、氨基糖苷類、氯霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類和氟喹諾酮類。膠體金免疫層析技術(shù)目前已成為牛奶中抗生素殘留檢測廣泛應(yīng)用的方法，大部分牛奶抗生素已經(jīng)建立了GICA測定法。

2.1 β-內(nèi)酰胺類（β-lactams）

β-內(nèi)酰胺類抗生素是一類化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有β-內(nèi)酰胺環(huán)的抗生素，常用于奶牛等家畜的個體臨床治療，會有部分殘留在牛乳中。應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)可檢測牛奶中14種β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留：青霉素G、氨芐青霉素、阿莫西林、鄰氯青霉素、苯唑青霉素、雙氯青霉素、萘夫西林、頭孢曲松、頭孢喹肟、頭孢哌酮、頭孢噻呋、頭孢氨芐、頭孢洛寧、頭孢唑啉。研究表明，青霉素G的檢測限為2～4μg/L，氨芐青霉素的檢測限為3～4 μg/L，阿莫西林的檢測限為3～5 μg/L，苯唑青霉素、鄰氯青霉素和雙氯青霉素的檢測限為6～30 μg/L，頭孢洛寧的檢測限為 10 μg/L，頭孢唑啉的檢測限為 15 μg/L，頭孢氨芐的檢測限為20 μg/L，萘夫西林和頭孢喹肟的檢測限為20μg/L，頭孢哌酮的檢測限為40～50μg/L，頭孢曲松的檢測限為50 μg/L，頭孢噻呋的檢測限為 4～100 μg/L。檢測時間為 10～15 min。

王利民[3]用膠體金免疫層析法測定牛奶中的青霉素，結(jié)果表明，當(dāng)樣品中青霉素質(zhì)量濃度低于4 ng/mL時，在測試區(qū)（T）內(nèi)會出現(xiàn)1條肉眼可見的紫紅色條帶；當(dāng)樣品中青霉素質(zhì)量濃度高于4ng/mL時，在測試區(qū)（T）內(nèi)出現(xiàn)淺紫紅色條帶，或不出現(xiàn)淺紫紅色條帶。

蒲明等[4]用β-內(nèi)酰胺類和四環(huán)素類多殘留二聯(lián)試紙條檢測牛奶中12種β-內(nèi)酰胺類抗生素，結(jié)果表明，檢測限為：青霉素G 2～4 μg/L，阿莫西林4～5 μg/L，氨芐青霉素 3～4 μg/L，苯唑青霉素 6～8μg/L，雙氯青霉素6～8μg/L，鄰氯青霉素6～8μg/L，萘夫西林20 μg/L，頭孢喹肟20 μg/L，頭孢曲松50 μg/L，頭孢哌酮 40～50 μg/L，頭孢噻呋 90～100 μg/L，頭孢洛寧 10 μg/L。

馮才偉等[5]研制出檢測牛奶中β-內(nèi)酰胺類和三聚氰胺膠體金試紙條，結(jié)果表明，牛奶中12種β-內(nèi)酰胺類抗生素檢測限分別為：青霉素G 2 μg/L，阿莫西林 3 μg/L，氨芐青霉素 3 μg/L，苯唑青霉素6 μg/L，雙氯青霉素 6 μg/L，鄰氯青霉素 6 μg/L，萘夫西林20μg/L，頭孢喹肟20μg/L，頭孢曲松50μg/L，頭孢哌酮40 μg/L，頭孢噻呋90 μg/L，頭孢洛寧10 μg/L；假陽性率低于5%，假陰性率為0，檢測時間不超過15 min。

林杰等[6]用基于膠體金免疫技術(shù)的ROSA法同時快速檢測新鮮牛奶中的四環(huán)素類和β-內(nèi)酰胺類藥物殘留，結(jié)果表明，檢測限為：青霉素G 3 μg/L，阿莫西林4μg/L，氨芐西林3μg/L，苯唑西林30μg/L，鄰氯青霉素 30 μg/L，雙氯青霉素 30 μg/L，頭孢氨芐 20 μg/L，頭孢唑啉 15 μg/L，頭孢噻呋 4 μg/L。檢測時間為10 min。

2.2 四環(huán)素類（Tetracyclines）

四環(huán)素類抗生素是由放線菌產(chǎn)生的一類廣譜抗生素，廣泛應(yīng)用于多種細(xì)菌及立克次氏體、衣原體、支原體等所致的感染。牛奶中四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、土霉素、氯四環(huán)素、金霉素5種四環(huán)素類抗生素殘留均可應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)進(jìn)行檢測，其中，四環(huán)素的檢測限為10～200 μg/L，土霉素的檢測限為30～100 μg/L，強(qiáng)力霉素的檢測限為40～100 μg/L，氯四環(huán)素的檢測限為 80～100 μg/L，金霉素的檢測限30～700 μg/L。檢測時間為5～15 min。

蒲明等[4]用β-內(nèi)酰胺類和四環(huán)素類多殘留二聯(lián)試紙條檢測牛奶中4種四環(huán)素類抗生素，結(jié)果表明，檢測限四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、土霉素、氯四環(huán)素均為 80～100 μg/L。

張銀志等[7]應(yīng)用金標(biāo)快速檢測試紙條對食品中四環(huán)素類抗生素檢測進(jìn)行了研究，以四環(huán)素多克隆抗體-膠體金復(fù)合物作為分析探針，四環(huán)素完全抗原作為競爭抗原，構(gòu)建分析體系，結(jié)果表明，試紙條檢測四環(huán)素的檢測限為200 μg/L，檢測時間不超過15 min。

付云潔等[8]用膠體金免疫層析法快速檢測食品中金霉素殘留，采用戊二醛交聯(lián)法制備金霉素-BSA免疫抗原，按照常規(guī)的免疫程序免疫新西蘭大白兔制備抗金霉素多克隆抗體，采用檸檬酸三鈉還原法制備顆粒大小為15 nm的膠體金，并制備抗體-膠體金復(fù)合物，以組裝檢測試紙，結(jié)果表明，金霉素的檢測限為0.7 μg/mL，檢測時間僅需5 min。

林杰等[6]用基于膠體金免疫技術(shù)的ROSA法同時快速檢測新鮮牛奶中的四環(huán)素類和β-內(nèi)酰胺類藥物殘留，結(jié)果表明，檢測限為金霉素30 μg/L，土霉素 30 μg/L，四環(huán)素 10 μg/L。檢測時間為 10 min。

汪善良等[9]用膠體金試紙條檢測牛奶中殘留的四環(huán)素類藥物，檢測限四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、金霉素均為 40 μg/L，土霉素為 80 μg/L。

2.3 氨基糖苷類（Aminoglycosides）

氨基糖苷類抗生素是一類含有氨基糖苷鍵的抗生素，抗菌譜廣，對需氧革蘭陰性桿菌具有強(qiáng)大的抗菌活性，臨床應(yīng)用廣泛。應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)可檢測牛奶中新霉素殘留，結(jié)果表明，新霉素的檢測限為10～200 μg/L，檢測時間為 3～5 min。

Jin等[10]用抗新霉素單克隆抗體鏈接在膠體金上的免疫層析法檢測牛奶中的新霉素，結(jié)果表明，檢測靈敏度為10 ng/mL，檢測結(jié)果與直接競爭性ELISA相一致。

劉淑華等[11]用膠體金免疫層析法檢測牛奶中新霉素的殘留量，結(jié)果表明，牛奶樣品無需稀釋，可直接檢測，牛奶中新霉素的檢測限為200 μg/L，檢測時間只需3～5 min；與磺胺類、四環(huán)素類、氯霉素類等藥物均無交叉反應(yīng)，檢測結(jié)果重復(fù)性較好。

2.4 氯霉素類（Chloramphenicols）

氯霉素是一種廣譜抗生素，具有良好的抗菌藥理特性，被廣泛應(yīng)用于各類家禽、家畜、水生動物及蜜蜂中各種傳染病的防治，結(jié)果表明，應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)可檢測牛奶中氯霉素殘留，檢測限為1 μg/L，檢測時間為 10～15 min。

王瑋等[12]制備了平均粒徑為20 nm的膠體金，用來標(biāo)記抗氯霉素多克隆抗體，將氯霉素半抗原與卵清蛋白的偶聯(lián)物包被在硝酸纖維素膜上作為檢測帶，羊抗兔二抗作為質(zhì)控帶，依據(jù)免疫競爭法原理，建立通過免疫膠體金滲濾式試紙條檢測牛乳中氯霉素殘留的方法，結(jié)果表明，樣品前處理方法簡便，檢出限為1μg/L，10～15min即可目測判斷結(jié)果。

王玉金等[13]建立了一種膠體金免疫層析法，可快速、簡易地檢測樣品中氯霉素的殘留含量。首先，把抗氯霉素單克隆抗體-膠體金復(fù)合物包被在膠體金結(jié)合墊上，同時將人工合成的氯霉素抗原包被在硝酸-醋酸纖維素薄膜表面上，作為檢測線（T線），其與待測樣品中氯霉素競爭結(jié)合膠體金標(biāo)記的氯霉素單克隆抗體，并能以顏色直觀顯示檢測的結(jié)果。用GICA測定60份牛奶樣品，結(jié)果表明，其中，陽性20份，陰性40份，試紙條以1 ng/mL為判斷限值，沒有出現(xiàn)假陽性及假陰性。

2.5 大環(huán)內(nèi)酯類（Macrolides）

大環(huán)內(nèi)酯類抗生素多為堿性親脂性化合物，對革蘭氏陽性菌及支原體抑制活性較高。應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)可檢測牛奶中泰樂菌素和替米考星等大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留，結(jié)果表明，泰樂菌素檢測限為25 μg/L，替米考星的檢測限為50 μg/L，檢測時間為10 min。

羅曉琴等[14]以泰樂菌素單克隆抗體為基礎(chǔ)，經(jīng)人工制備替米考星-卵清蛋白偶聯(lián)物和泰樂菌素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，應(yīng)用競爭抑制免疫層析原理，研制出泰樂菌素和替米考星膠體金試紙條，同時檢測牛奶中的泰樂菌素和替米考星，結(jié)果表明，牛奶中泰樂菌素和替米考星的檢測限分別為25，50 μg/L；假陽性率低于5%，假陰性率為0，檢測時間為10 min，與其他大環(huán)內(nèi)酯類抗生素?zé)o交叉反應(yīng)。

2.6 磺胺類 （Sulfonamides）

磺胺類抗生素能抑制革蘭氏陽性菌及一些陰性菌，可治療多種細(xì)菌感染，在獸醫(yī)臨床上廣泛應(yīng)用于治療由敏感細(xì)菌感染的各種畜禽疾病。應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)可檢測牛奶中磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺氯噠嗪、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺苯酰、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺異噁唑、磺胺甲氧噠嗪、磺胺多辛12種磺胺類抗生素的殘留，結(jié)果表明，磺胺二甲基嘧啶的檢測限為1～20 μg/L，磺胺異噁唑的檢測限為10 μg/L，磺胺氯噠嗪和磺胺對甲氧嘧啶的檢測限為30 μg/L，磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶和磺胺苯酰的檢測限為50 μg/L，磺胺嘧啶的檢測限為10～60 μg/L，磺胺甲氧噠嗪和磺胺多辛的檢測限為70 μg/L，磺胺喹噁啉和磺胺甲噁唑的檢測限為80 μg/L。檢測時間為10～15 min。

張佳宜等[15]采用檸檬酸三鈉法制備40 nm膠體金，電鏡鑒定后標(biāo)記磺胺二甲嘧啶多克隆抗體，磺胺二甲嘧啶半抗原-OVA和羊抗兔二抗分別包被在硝酸纖維素膜上，金標(biāo)抗體噴涂在玻璃纖維墊上，制成免疫層析快速檢測試紙條，結(jié)果表明，牛奶中的磺胺二甲基嘧啶殘留檢出限為1 μg/L，可在10 min內(nèi)完成檢測。

王喜亮等[16]用膠體金標(biāo)記磺胺嘧啶單克隆抗體作為顯色劑，磺胺嘧啶競爭物包被于硝酸纖維素層析膜上作為捕獲試劑，采用競爭反應(yīng)模式制成膠體金免疫層析試紙，結(jié)果表明，該免疫層析試紙可以在15 min內(nèi)完成對牛奶中磺胺嘧啶殘留的半定量檢測，讀條系統(tǒng)判定靈敏度為5 ng/mL，肉眼判定靈敏度為10 ng/mL。

李海龍等[17]用膠體金免疫層析法測定牛奶中的磺胺類藥物，結(jié)果表明，檢測限為：磺胺嘧啶60μg/L，磺胺二甲基嘧啶20 μg/L，磺胺喹噁啉80 μg/L，磺胺氯噠嗪30 μg/L，磺胺間二甲氧嘧啶50 μg/L，磺胺間甲氧嘧啶 50 μg/L，磺胺甲噁唑 80 μg/L，磺胺苯酰 50 μg/L，磺胺對甲氧嘧啶 30 μg/L，磺胺異噁唑10μg/L，磺胺甲氧噠嗪70μg/L，磺胺多辛70μg/L，假陽性率為2%，假陰性率為0。

2.7 氟喹諾酮類（Fluoroquinolones）

氟喹諾酮類藥物是第3代喹諾酮類藥物，具有高效、廣譜、低毒等特點，在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中廣泛應(yīng)用于預(yù)防與治療動物疾病。應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)可檢測牛奶中恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星、氟甲喹、達(dá)氟沙星、依諾沙星、惡喹酸11種氟喹諾酮類抗生素殘留，結(jié)果表明，恩諾沙星和環(huán)丙沙星的檢測限為20～50 μg/L，沙拉沙星、雙氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星、氟甲喹和達(dá)氟沙星的檢測限均為20 μg/L，依諾沙星和惡喹酸的檢測限為 40 μg/L。檢測時間為5～10 min。

魏東等[18]以沙拉沙星（SALX）多克隆抗體與膠體金結(jié)合為金標(biāo)抗體，將純化好的金標(biāo)抗體噴涂在玻璃纖維墊上，包被抗原SALX-OVA和山羊抗兔二抗分別包被在硝酸纖維素膜上，制成免疫層析快速檢測試紙條，結(jié)果表明，可同時檢測牛奶中的沙拉沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星殘留，試紙條的靈敏度為30 ng/mL，檢測時間為5～10 min。

何丹婷等[19]應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)建立了恩諾沙星和環(huán)丙沙星快速檢測試紙，結(jié)果表明，對牛奶樣本的檢測限為50 μg/L，能夠特異性地檢測恩諾沙星和環(huán)丙沙星。

萬宇平等[20]用膠體金標(biāo)記的抗氟喹諾酮類單克隆抗體制備了氟喹諾酮類膠體金免疫檢測試紙條，用于牛奶中11種氟喹諾酮類藥物殘留的檢測，結(jié)果表明，對牛奶中恩諾沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、氟甲喹、達(dá)氟沙星的檢測限為20 μg/L，對依諾沙星、惡喹酸的檢測限為40 μg/L。檢測時間為5 min。試紙條的檢測結(jié)果與儀器檢測結(jié)果一致，重復(fù)性較好，在4℃條件下可以保存12個月。

3 展望

牛奶是健康飲食中不可或缺的食物，人類可以從中獲取能量、優(yōu)質(zhì)蛋白、礦物質(zhì)及維生素等營養(yǎng)物質(zhì)[21]。近年來，抗菌藥物被越來越廣泛地用于牛奶生產(chǎn)，如廣譜的氟喹諾酮類，高效、價廉的青霉素被廣泛用于奶牛疾病和乳房炎的防治[22]；四環(huán)素、恩諾沙星等藥物用于治療奶牛多殺性巴氏桿菌病[23]，因此，牛奶中抗生素殘留問題日益受到國際社會的重視[24]。為加強(qiáng)牛奶安全監(jiān)管提供強(qiáng)有力的技術(shù)保障[25]，膠體金免疫層析技術(shù)近年來得到廣泛應(yīng)用。膠體金免疫層析技術(shù)不僅操作簡便、快速、特異，而且特別適用于廣大基層檢驗人員的現(xiàn)場檢測。由于樣品成分復(fù)雜，容易影響抗原抗體反應(yīng)和膠體金顆粒與蛋白質(zhì)的吸附，檢測結(jié)果常出現(xiàn)假陽性[26]。因此，膠體金免疫層析技術(shù)在未來還需向幾方面發(fā)展。

3.1 提高檢測靈敏度

從膠體金免疫層析技術(shù)在牛奶抗生素檢測的應(yīng)用結(jié)果可以看出，牛奶中抗生素殘留的檢測限為1～700 μg/L，檢測限范圍較大。因此，膠體金免疫層析技術(shù)在未來應(yīng)提高檢測靈敏度。

3.2 擴(kuò)大檢測范圍

膠體金免疫層析技術(shù)至今已應(yīng)用于14種β-內(nèi)酰胺類抗生素，5種四環(huán)素類抗生素，1種氨基糖苷類抗生素，1種氯霉素類抗生素，2種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，12種磺胺類抗生素，11種氟喹諾酮類藥物的檢測。牛奶中使用的抗生素種類繁多，因此，膠體金免疫層析技術(shù)應(yīng)擴(kuò)大抗生素殘留檢測范圍。

3.3 實現(xiàn)多元檢測

目前，膠體金免疫層析技術(shù)可同時檢測鮮奶中的四環(huán)素類和β-內(nèi)酰胺類藥物殘留[8]、牛奶中泰樂菌素和替米考星[14]和牛奶中的沙拉沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星的殘留[18]。牛奶中使用的抗生素種類繁多，不僅增加了藥物殘留的幾率，也加大了檢測的難度。因此，應(yīng)開發(fā)出同時檢測多種藥物的試紙條，大大節(jié)省檢測時間及成本。

3.4 實現(xiàn)定量檢測

現(xiàn)在，膠體金免疫層析技術(shù)都是通過顏色判斷結(jié)果，很容易導(dǎo)致高的假陽性和假陰性幾率，結(jié)果也無法準(zhǔn)確定量。用免疫層析試紙可以在15 min內(nèi)完成對牛奶中磺胺嘧啶殘留的半定量檢測[16]。因此，應(yīng)研究膠體金免疫層析技術(shù)，實現(xiàn)定量檢測。

綜上所述，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，膠體金免疫層析技術(shù)不僅發(fā)展?jié)摿薮?，而且市場和?yīng)用前景廣闊。在未來的牛奶抗生素殘留檢測中，膠體金免疫層析技術(shù)將會成為重要的技術(shù)手段，并將引起世界各國的廣泛重視。

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