曹惠鵑，周 錦，孫瑩杰，姚 婧，張鐵錚

·基礎研究·

N-乙酰半胱氨酸對體外循環(huán)大鼠血腦屏障功能的影響

曹惠鵑，周 錦，孫瑩杰，姚 婧，張鐵錚

目的探討N-乙酰半胱氨酸（NAC）對體外循環(huán)（CPB）大鼠血腦屏障功能（BBB）的影響。方法將36只成年雄性SD大鼠隨機分為3組：假手術組（S組）、CPB組（C組）、CPB+NAC組（N組）。N組在預充液中加入NAC 100 mg/kg，然后以20 mg/（kg·h）速度輸注直到停轉流，C組輸注等量生理鹽水。停CPB后2 h，采集上腔靜脈血測定血漿腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-6（IL-6）水平。每組隨機取6只測腦組織伊文思藍（EB）含量，另6只做腦組織腦丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-px）含量測定和大鼠BBB超微結構的觀察。結果N組血漿TNF-α和IL-6水平，腦組織MDA、GSH-px和EB含量均顯著優(yōu)于C組；N組海馬區(qū)BBB超微結構的損傷程度也較C組明顯減輕。結論NAC可減輕CPB大鼠BBB的損傷程度，其機制可能與其抗炎、抗氧化作用有關。

N-乙酰半胱氨酸；體外循環(huán)；血腦屏障

體外循環(huán)（cardiopulmonary bypass，CPB）可使血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）功能失調(diào)［1］，BBB功能障礙可導致心臟手術后的神經(jīng)并發(fā)癥。CPB繼發(fā)BBB功能失調(diào)的病因尚不清楚，但與CPB期間的低灌注狀態(tài)、缺血/再灌注、炎性介質(zhì)及血管

內(nèi)微栓等密切相關。N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）是細胞維持正常生理功能的重要化合物-谷胱甘肽（GSH）的前體物質(zhì)，對氧化應激、缺血再灌注損傷等有一定的防治作用。本研究通過建立大鼠CPB模型，探討NAC對CPB大鼠BBB功能的影響。

1 資料與方法

1.1 動物選擇與分組 沈陽軍區(qū)總醫(yī)院實驗動物中心提供的健康雄性清潔級Sprague-Dawley大鼠36只，4～6個月齡，體重330～400 g，按隨機數(shù)字表分為3組：假手術組（S組）、CPB組（C組）、CPB+ NAC組（N組），每組12只。S組僅置管，不進行CPB；C組和N組進行CPB 1 h，然后觀察2 h。N組在預充液中加入NAC（美國Sigma公司，批號A-7250）100 mg/kg，然后以20 mg/（kg·h）速度輸注1 h直到停轉流，C組輸注等容量生理鹽水。停CPB后2 h，采集上腔靜脈血測定血漿腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-6（IL-6）水平。每組隨機取6只測腦組織伊文思藍（Evans blue，EB）含量，另6只做腦組織腦組織丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-px）含量測定和大鼠BBB超微結構的觀察。

1.2 實驗材料 恒流蠕動泵（BT00-300M型，保定蘭格恒流泵有限公司），配套硅膠管（內(nèi)徑4 mm），大鼠專用膜式氧合器（表面積0.05 m2，預充液3 ml，廣東科威醫(yī)療器械有限公司），小動物呼吸機（TKR-200C型，江西省特力麻醉呼吸設備公司），多功能監(jiān)測儀（日本光電公司），全自動溫血儀（美國BIGGER公司），電子天平（FA314型，上海?？惦娮觾x器廠），分光光度計（CM3500D型，日本美能達），伊文思藍（美國Sigma公司），TNF-α和IL-6放免試劑盒（天津九鼎醫(yī)學生物工程有限公司），MDA、GSH -px測試盒（南京建成生物工程研究所），透射電鏡（JEM-1200EX型，日本電子公司）。

1.3 CPB方法大鼠在實驗前禁食、水6 h。腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg麻醉，窺喉后經(jīng)口氣管插管，接呼吸機行機械通氣，吸入氧濃度1.0，調(diào)整潮氣量和呼吸頻率維持呼氣末二氧化碳32～42 mm Hg。CPB環(huán)路連接、管道預充及管理參照文獻［2］介紹的方法。

1.4 標本留取及檢測

1.4.1 腦組織EB含量的測定 參照Ding-Zhou L等的方法［3］，應用EB作為示蹤劑，監(jiān)測BBB的損傷程度，計算出每克組織的EB含量（μg/g）。

1.4.2 腦組織MDA、GSH-px含量測定 低溫下取腦組織，制備10%的腦組織勻漿，根據(jù)測定試劑盒說明書對每毫克腦組織勻漿中MDA、GSH-px進行測定。

1.4.3 血漿TNF-α和IL-6濃度的測定 應用放射免疫分析法測定大鼠血漿TNF-α和IL-6濃度。

1.4.4 透射電鏡觀察 將取出的大鼠左側海馬區(qū)腦組織小塊，置入1%鋨酸固定，乙醇梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋后切片，鈾、鉛雙染色，置于透射電鏡下觀察海馬區(qū)神經(jīng)元細胞的超微結構。

1.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均值±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 腦組織EB含量 與S組比較，其余組大鼠海馬區(qū)腦組織EB含量升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與C組比較，N組海馬區(qū)腦組織EB含量降低（P＜0.05），見表1。

2.2 腦組織MDA和GSH-px含量的變化 與S組比較，其余組腦組織MDA含量升高（P＜0.05）、GSH-px含量降低（P＜0.05）；與C組比較，N組腦組織MDA降低（P＜0.05）、GSH-px含量升高（P＜0.05），見表1。

2.3 血漿TNF-α和IL-6水平的變化 與S組比較，C組和N組血漿TNF-α和IL-6水平均升高（P＜0.05）；與C組比較，N組血漿TNF-α和IL-6水平均降低（P＜0.05），見表1。

2.4 BBB超微結構的改變 S組BBB基膜均勻一致，完整性良好，內(nèi)皮細胞間的緊密連接完整。C組BBB基膜變厚，內(nèi)皮細胞不均勻，微血管腔狹窄，紅細胞運行受阻，內(nèi)皮細胞間緊密連接不清。N組BBB基膜輕微腫脹，紅細胞運行不受限，內(nèi)皮細胞間的緊密連接清晰，見圖1～3。

表1 各組腦組織EB、MDA和GSH-px含量及血漿TNF-α和IL-6水平的比較（±s）

表1 各組腦組織EB、MDA和GSH-px含量及血漿TNF-α和IL-6水平的比較（±s）

注：與S組比較?P＜0.05；N組與C組比較＃P＜0.05

項目S組C組N組EB含量（μg/g）0.67±0.215.85±0.81?2.03±0.47?＃MDA（nmol/mg）15.02±4.3870.54±26.27?31.09±12.65?＃GSH-px（U/mg）2.93±0.612.00±0.32?2.45±0.43?＃TNF-α（μg/L）0.92±0.162.55±0.82?1.70±0.61?＃IL-6（ng/L）56.84±8.87173.34±39.22?96.45±23.63?＃

圖1 S組電鏡結果（×7200）

圖2 C組電鏡結果（×7200）

圖3 N組電鏡結果（×7200）

3 討 論

腦神經(jīng)損傷是心臟外科手術的一個嚴重的并發(fā)癥。損傷的嚴重程度從輕微的認知功能障礙到中風，增加住院時間、費用和康復需求，并導致生活質(zhì)量下降［4］。BBB是由腦毛細血管內(nèi)皮細胞、基膜和神經(jīng)膠質(zhì)膜構成的血漿與腦細胞外液間的屏障，對腦的營養(yǎng)物質(zhì)供應、維持神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定和保持神經(jīng)元一定的功能等方面起重要作用。BBB破壞是腦損傷的危險因素，并可引發(fā)一系列神經(jīng)、精神并發(fā)癥。CPB可增加BBB的通透性［1］，使BBB功能失調(diào)，導致心臟手術后的神經(jīng)并發(fā)癥。

NAC是廣泛應用的抗氧化劑，具有潛在的抗氧化和抗炎作用。NAC通過中和氧自由基、保護細胞膜、維持內(nèi)皮細胞功能發(fā)揮保護作用［5］。研究表明，在損傷后靜脈應用NAC能顯著改善缺氧復氧新生豬的頸動脈血流和氧供，減少腦皮質(zhì)caspase-3和脂質(zhì)過氧化物含量的增加［6］。在預充液中加入NAC，能夠減輕CPB對大鼠的腎損傷，且呈劑量依賴性［7］。而NAC對CPB所誘導的BBB損傷是否具有保護作用，國內(nèi)外罕見報道。心胸手術過程中應用CPB使機體與非生理表面接觸、非搏動血流、低灌注狀態(tài)等可激活氧化應激反應和全身炎癥反應。因此，選用具有抗氧化性質(zhì)的試劑減輕氧化應激和氧化應激引起的炎癥反應，探討其對CPB大鼠BBB結構和功能的影響。

EB屬于一種常用的染料制劑，因其分子量大小與血液中的白蛋白相近，并可與血液中的白蛋白結合，因此，常被用于作為觀察BBB完整性的示蹤劑。本實驗結果顯示，進行CPB的大鼠腦組織EB含量明顯高于假手術組，說明CPB可使BBB結構受損，導致屏障作用減弱，通透性增加，使生理狀態(tài)下不能通透的物質(zhì)穿越BBB進入組織間隙，繼發(fā)血管源性腦水腫。而N組海馬區(qū)腦組織EB含量降低，表明一定劑量的NAC可減輕CPB對大鼠BBB的損傷。電鏡結果也表明，CPB使BBB超微結構發(fā)生一定程度的改變，一定劑量的NAC可減輕BBB超微結構的改變。

TNF-α是引起炎性級聯(lián)反應的一個重要而又具有廣泛生物學活性的細胞因子，它也是炎癥反應釋放最早和最重要的內(nèi)源性介質(zhì)。IL-6是腦損傷炎癥反應鏈中的一種重要炎性細胞因子，主要通過誘導最初的炎性級聯(lián)反應、誘導血管內(nèi)皮黏附因子表達、增強興奮性氨基酸毒性作用、降低腦血流、增加血腦屏障通透性等機制在繼發(fā)性腦損傷中發(fā)揮作用［9］。基于上述原因，以TNF-α和IL-6作為反映CPB中炎性反應的指標。本研究結果表明，NAC可減少CPB誘導的大鼠腦組織MDA含量的升高及GSH-px含量的降低，可降低血漿TNF-α、IL-6水平的升高，提示NAC可降低CPB所誘發(fā)的氧化應激和炎癥反應程度。

綜上所述，在CPB過程中應用一定劑量的NAC可減輕CPB大鼠BBB的損傷，其機制可能與其抗炎、抗氧化作用有關。

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Protective effects of N-acetylcysteine on blood-brain barrier in the rat cardiopulmonary bypass model

Cao Hui-juan，Zhou Jin，Sun Ying-jie，Yao Jing，Zhang Tie-zheng
Department of Anesthesiology of the General Hospital of ShenYang Military Region，Liaoning Shenyang 110016，China

Zhou jin，Email：zhoujin6＠126.com

ObjectiveTo investigate the protective effects of N-acetylcysteine（NAC）on blood-brain barrier（BBB）in the rat cardiopulmonary bypass（CPB）model.MethodsThirty-six male adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups（twelve for each group），including sham-operated control group（group S），vehicle control group（group C）and CPB plus NAC group（group N）.Rats in group N were treated with NAC 100 mg/kg into CPB prime followed by infusion at 20 mg/（kg·h）until the cessation of CPB，and rats in group C were treated with the same volume of natural saline.The samples of plasma and brain tissue were collected two hours after CPB.The plasma levels of tumor necrosis factor-α（TNF-α）and interleukin-6（IL-6）were determined.Took six rats of each group to measure the Evans blue content of brain tissue，took the other six to determine the contents of brain tissue of malondialdehyde（MDA），glutathione peroxidase（GSH-px）and observe the ultrastructure of BBB.ResultsThe plasma levels of TNF-α，IL-6 in group N were significantly better than those of group C.The contents of brain tissue of MDA，GSH-px and Evans blue in group N were significantly better than those of group C.Compared with group C，the damage degree of ultrastructure of hippocampal BBB in group N was significantly reduced.ConclusionNAC could reduce the injury of BBB inducced by CPB in the rat model by antioxidant and anti-inflammatory mechanisms.

N-acetylcysteine；Cardiopulmonary bypass；Blood-brain barrier

R654.1

A

1672-1403（2013）01-0034-04

2011-12-19）

2012-03-17）

110016沈陽，沈陽軍區(qū)總醫(yī)院麻醉科［曹惠鵑（博士研究生）］

周錦，Email：zhoujin6＠126.com