張艷平，唐成程，許崇波

1.大連大學(xué) a.生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院；b.醫(yī)學(xué)院；遼寧 大連 116622；2.吉林大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林 長春 130062

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）是引起各種動物壞死性腸炎、腸毒血癥、人畜創(chuàng)傷性氣性壞疽及人類食物中毒的主要病原菌之一，該菌的致病因子是其所產(chǎn)生的外毒素。迄今，已發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素有12種（α、β、γ、δ、ε、η、θ、ι、κ、λ、μ和ν）之多，但起主要致病作用的只有4種（α、β、ε和ι），據(jù)此將該菌分為A、B、C、D、E等5個毒素型。各型產(chǎn)氣莢膜梭菌均產(chǎn)生α毒素（C.perfringens alpha-tox?in，CPA），它是產(chǎn)氣莢膜梭菌最重要的致病毒素之一[1-2]，國內(nèi)外學(xué)者對產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素進行了大量的研究，并取得了一些研究成果。在此，我們對產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的生物學(xué)特性、基因克隆與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、基因表達與基因融合、基因定點突變與結(jié)構(gòu)分析、N端和C端的結(jié)構(gòu)與功能等方面的研究進展進行簡要綜述。

1 生物學(xué)特性

α毒素是一種多功能性金屬酶，具有磷脂酶C（PLC）和鞘磷脂酶（SMase）等2種酶活性，能同時水解磷脂酰膽堿和鞘磷脂。α毒素依靠這2種酶活性，水解組成細胞膜的主要成分膜磷脂，破壞細胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，導(dǎo)致細胞裂解，從而具有細胞毒性、溶血活性、致死性和血小板聚集等特性。α毒素的溶血活性具有冷熱溶血效應(yīng)（hot-cold hemolysis），即α毒素在37℃與紅細胞作用時，紅細胞并不發(fā)生裂解，只有當紅細胞變冷至4℃時才會發(fā)生裂解。已在小鼠、家兔、綿羊等紅細胞上發(fā)現(xiàn)了α毒素的這種冷熱溶血效應(yīng)[3]。α毒素可被EDTA、鄰二氮雜菲可逆性抑制，還可被乙醚偶聯(lián)的磷脂酰膽堿抑制。去污劑可增加α毒素活性，這是由于磷脂或甘油二酯的可溶性，而不是由于去污劑對蛋白質(zhì)的作用。α毒素對胰酶敏感，2.5%的胰酶與α毒素于37℃作用1 h，即可使其完全失活[4]。此外，Titball等報道[5]，當把α毒素加熱至60～70℃時就可以使其失去活性，而當進一步加熱到100℃時，又可以恢復(fù)部分生物學(xué)活性。

2 基因克隆與轉(zhuǎn)錄調(diào)控

α毒素基因位于染色體上，其結(jié)構(gòu)基因大小為1194 bp，編碼的產(chǎn)物由398個氨基酸殘基組成，相對分子質(zhì)量約為45.5×103。其中信號肽為28個氨基酸殘基，其余370個殘基構(gòu)成的成熟肽的相對分子質(zhì)量約為43×103。α毒素編碼區(qū)G+C含量為34%，SD序列為CGGGGG，-10區(qū)序列為TATAAT，-35區(qū)序列為GTGAGG，終止密碼子為2個連在一起的TAA。Katayama等[6]比較了A型和C型產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的基因序列，證實二者有18個堿基不同，結(jié)果導(dǎo)致6個氨基酸殘基不同，其他部分相同。雖然A型菌α毒素成熟肽與C型菌α毒素成熟肽有6個氨基酸殘基的不同，但卻具有相同的磷脂酶C活性和溶血活性。Effat等[7]比較了5株A型菌株、1株B型菌株、1株C型菌株、2株D型菌株和1株E型菌株的α毒素的核苷酸序列及編碼的氨基酸序列，在1194 bp編碼區(qū)里，不同菌株之間平均有1.3%的核苷酸序列不同，有1.2%的氨基酸序列不同，但并不影響α毒素本身的活性，各型菌株產(chǎn)生的α毒素具有相同的生物學(xué)功能。

Sakurai等[8]報道，5種毒素型產(chǎn)氣莢膜梭菌的α毒素的產(chǎn)量是不同的，甚至同一種毒素型產(chǎn)氣莢膜梭菌在不同生長時期的α毒素的產(chǎn)量亦不同[8]。Toy?onaga等[9]研究證實α毒素的產(chǎn)量是在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控的，他們將啟動子-35區(qū)上游富含A+T序列缺失0.7 kb，結(jié)果α毒素的表達量增加10倍，表明該區(qū)在基因表達時呈負調(diào)控作用。核苷酸序列分析證明，在α毒素基因上游-66～-40間存在3個周期性重復(fù)的（dA）5-6序列，當缺失含2個（dA）5-6區(qū)的77 bp片段時，α毒素表達量異常增加。這些實驗結(jié)果充分說明了α毒素啟動子上游的基因序列對α毒素基因的轉(zhuǎn)錄呈負調(diào)控作用，這種調(diào)控作用可能是由于該區(qū)DNA扭曲的潛在影響。Katayama等[6]報道，在相同培養(yǎng)條件下，A型菌株比C型菌株的mRNA含量高23倍。另外還證實，A型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株中含有特異的DNA結(jié)合蛋白，如果將α毒素基因分成3個片段A、B和C，A型和C型菌株都含有特異結(jié)合片段A的特異DNA結(jié)合蛋白，只有A型菌株含有特異結(jié)合片段B的特異DNA結(jié)合蛋白，這種特異DNA結(jié)合蛋白可能是A型菌株α毒素產(chǎn)量高于C型菌株的一個因素。Tsutsui等[10]報道，α毒素高產(chǎn)毒菌株A型產(chǎn)氣莢膜梭菌NCTC8237和PB6K的mRNA含量比低產(chǎn)毒菌株B、C、D型的mRNA含量高40倍左右。從上述這些實驗結(jié)果可以推測，α毒素的產(chǎn)量可能是像多數(shù)原核生物一樣是在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控的。

3 基因表達與基因融合

α毒素的啟動子是最強的啟動子之一，可被大腸桿菌的RNA聚合酶所識別，因而α毒素在自身啟動子下不僅可在產(chǎn)氣莢膜梭菌本身中高效表達，也可在大腸桿菌中得到高效表達。此外，也可將其置于其他啟動子下，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后獲得高效表達。許崇波等[11]利用PCR技術(shù)，從A型產(chǎn)氣莢膜梭菌標準株染色體DNA中擴增出α毒素基因，構(gòu)建了含α毒素基因的重組大腸桿菌BL21（DE3）（pXETA02）。經(jīng)酶切鑒定和測序證實，構(gòu)建的表達質(zhì)粒pXETA02含有α毒素基因序列。經(jīng)SDS-PAGE、Western印跡分析和ELISA檢測，重組菌株表達的α毒素能夠被α毒素單抗識別。以IPTG為誘導(dǎo)劑，優(yōu)化表達條件后，α毒素的表達量占菌體總蛋白的34.83%。以乳糖為誘導(dǎo)劑，優(yōu)化表達條件后，α毒素的表達量占菌體總蛋白的23.82%。動物實驗結(jié)果表明，用重組α毒素免疫的小鼠可以抵抗1 MLD的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌標準株C57-1毒素攻擊。

許崇波等[12-14]進行了α-β2-β1抗原基因融合、表達及其免疫原性研究。首先，從C型產(chǎn)氣莢膜梭菌染色體基因組中擴增了1.2 kb的α毒素基因、0.95 kb的β1毒素基因、0.72 kb的β2毒素基因，酶切回收的3種毒素基因片段分別插入表達載體pET-28c，構(gòu)建了3種重組質(zhì)粒pETXA1、pETXB1、pETXB2，構(gòu)建了α-β1毒素融合基因重組質(zhì)粒 pETXAB1、β1-β2毒素融合基因重組質(zhì)粒pETXB1-2和α-β2-β1融合基因重組質(zhì)粒pXETAB2B1。以IPTG為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)重組菌株表達的優(yōu)化條件是:培養(yǎng)基pH7.5，培養(yǎng)溫度37℃，IPTG濃度0.4 mmol/L，菌體生長密度D600nm達到1.0時加入IPTG，誘導(dǎo)5 h，此時α-β2-β1融合蛋白的表達量占菌體總蛋白的22%。α-β2-β1融合基因表達產(chǎn)物的Western印跡結(jié)果表明，在相對分子質(zhì)量約95×103處出現(xiàn)C型產(chǎn)氣莢膜梭菌抗血清的識別條帶，表明α-β2-β1融合蛋白可以被特異性抗體識別。生物學(xué)功能測定和動物安全性試驗證實重組菌株無致病性，十分安全。免疫原性研究表明，α-β2-β1融合蛋白具有良好的免疫原性和中和α、β1、β2毒素活性的能力，為今后從事產(chǎn)氣莢膜梭菌基因工程亞單位疫苗奠定了良好的工作基礎(chǔ)。

4 基因定點突變與結(jié)構(gòu)分析

α毒素的氨基酸組成對其生物學(xué)功能有著重要的影響，其中個別氨基酸對其生物活性起著十分重要的作用[15]。Guillouard等[16-17]將56位的天門冬氨酸突變成絲氨酸、天門冬酰氨、谷氨酸或谷氨酰氨之后，突變的毒素完全喪失了α毒素的溶血活性、磷脂酶C活性和鞘磷脂酶活性。當130位的天門冬酰氨發(fā)生突變后，突變毒素活性只有天然毒素的約1/100，同時還證實，56位的天門冬酰氨對α毒素的酶催化作用是必需的，而130位天門冬酰氨對其結(jié)構(gòu)的維持是必需的。盡管上述不同位點的氨基酸發(fā)生突變之后，對α毒素的生物學(xué)活性有著不同程度的影響，甚至可使其生物活性完全喪失，但仍然保持著天然毒素的部分或全部抗原性。

Nagahama等[18]利用定點突變技術(shù)，研究了組氨酸殘基在α毒素中的作用。他們將第68位組氨酸殘基突變成甘氨酸殘基，結(jié)果突變的α毒素完全喪失了α毒素本身的磷脂酶C活性、鞘磷脂酶活性、溶血活性和致死性。如果將第126位、136位組氨酸殘基突變成甘氨酸殘基，突變的α毒素活性只有天然α毒素活性的1/100。如果將第46、207、212、241位組氨酸殘基突變成甘氨酸殘基，結(jié)果突變的α毒素活性和天然α毒素活性相比沒有什么變化，這表明上述4個位置的組氨酸殘基對α毒素具有生物活性不是必需的。Nagaham等[19]證實，74位的酪氨酸也是一個對α毒素的生物學(xué)活性起著重要作用的關(guān)鍵氨基酸殘基，當其被突變置換后，可使其生物學(xué)活性降低至1/250。作者還研究了N端酶活位點附近57位和65位酪氨酸的作用，將以上位點用丙氨酸、亮氨酸或苯丙氨酸突變后，沒有影響鞘磷脂酶的活性，然而丙氨酸和亮氨酸突變體在羊紅細胞中的溶血性和對脂質(zhì)體的結(jié)合都顯著降低。將2個突變體毒素結(jié)合到脂質(zhì)體上，并用環(huán)境敏感熒光基團標記后追蹤，發(fā)現(xiàn)其存在于雙分子層疏水區(qū)。以上實驗證實57位和65位酪氨酸殘基對α毒素滲透進雙分子膜和鞘磷脂催化位點過程起著重要作用，但不參與酶活反應(yīng)。Na?gahama等[20]將152位的谷氨酸突變成甘氨酸或谷氨酰氨后，其生物學(xué)活性完全喪失，但當用天門冬酰氨置換后則不能完全喪失這些活性。上述位點氨基酸的突變并不影響α毒素與綿羊紅細胞的結(jié)合及從溶液中吸收游離鋅離子的特性。Alape-Giro等[21]將α毒素結(jié)合鈣離子的269位和336位天冬氨酸殘基突變?yōu)樘於０泛螅淙苎钚韵陆盗?0%，細胞毒性降低至1/1000。實驗結(jié)果還證實體內(nèi)鞘磷脂酶活性和C端區(qū)域?qū)τ隗w內(nèi)肌肉毒性是非常重要的，上述突變體毒素肌肉毒性相比野生型減少了12%。因此，該實驗解釋了所研究的氨基酸殘基對于產(chǎn)氣莢膜梭菌磷脂酶C毒性的重要性。

許崇波等[22]對A型產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素第68位組氨酸突變體及其結(jié)構(gòu)進行了研究。他們將A型產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素（CPA）第68位組氨酸（CAT）定點突變成甘氨酸（GGT），構(gòu)建了含CPA突變基因表達質(zhì)粒的重組大腸桿菌BL21（DE3）（pMCPA-H68G），其表達量占菌體總蛋白的31.65%。應(yīng)用EXPASY服務(wù)器（http://www.expasy.org/tools）的 SOPMA 法對CPA和CPA-His68Gly突變體分子進行2級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果顯示CPA蛋白含有118個α螺旋、78個β折疊、44個β轉(zhuǎn)角、130個無規(guī)則卷曲，CPA-His68Gly突變體含有118個α螺旋、79個β折疊、45個β轉(zhuǎn)角、128個無規(guī)則卷曲。從預(yù)測的CPA及CPA-His68Gly突變體分子的2級結(jié)構(gòu)來看，二者除第68突變位點由無規(guī)則卷曲變成β轉(zhuǎn)角和第69位由無規(guī)則卷曲變成β折疊外，其余的2級結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生變化，說明CPA和CPA-His68Gly突變體分子的2級結(jié)構(gòu)基本一致。以蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（PDB）中已解析的CPA三維結(jié)晶結(jié)構(gòu)（3D）為模板，在線（http://www.expasy.org/swissmod/SWISS-MODEL.html）利用同源模型構(gòu)建CPA和CPA-His68Gly突變體分子的3D結(jié)構(gòu)，應(yīng)用Rasmol分析軟件繪制其3D結(jié)構(gòu)圖，結(jié)果顯示CPA共有10段α螺旋，8段β折疊，而CPA-His68Gly突變體的3級結(jié)構(gòu)與CPA的3級結(jié)構(gòu)相似。同時，將重組大腸桿菌BL21（DE3）（pMCPA-H68G）的培養(yǎng)上清、菌體及菌體裂解物涂布于卵黃瓊脂平板上，均不出現(xiàn)特征性渾濁環(huán)，表明它們不能分解卵黃瓊脂平板中的卵磷脂，這說明重組菌株已不具備CPA的磷脂酶C活性，而A型產(chǎn)氣莢膜梭菌標準株C57-1培養(yǎng)上清在卵黃瓊脂平板上出現(xiàn)了特征性渾濁環(huán)。同時經(jīng)腹腔注射或口服途徑接種重組大腸桿菌BL21（DE3）（pMCPA-H68G），結(jié)果3周后小鼠全部存活，無異常表現(xiàn)，經(jīng)剖檢觀察無病理變化，表明該菌株喪失了CPA活性，已無致病性，而A型產(chǎn)氣莢膜梭菌標準株C57-1對照組則出現(xiàn)典型的臨床癥狀和病理變化。免疫實驗結(jié)果表明，重組大腸桿菌BL21（DE3）（pMCPA-H68G）滅活菌體免疫組保護率為94%（75/80），A型產(chǎn)氣莢膜梭菌標準株C57-1類毒素免疫組保護率為95%（76/80），而生理鹽水對照組20只小鼠全部死亡，這說明構(gòu)建的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌CPA-His68Gly突變體蛋白和A型產(chǎn)氣莢膜梭菌標準株C57-1類毒素的免疫保護效果基本相同。

5 N端和C端的結(jié)構(gòu)與功能

Titball等[23]對α毒素是否由2個區(qū)域組成進行了研究，他們構(gòu)建了一個截短的α毒素CPA1-249，其表達產(chǎn)物保留了磷脂酶C活性，能水解磷脂酰膽堿，但卻失去了α毒素的鞘磷脂酶活性、溶血活性和致死性，這表明α毒素N端可能具有溶血活性和致死性。隨后，Titball等[5]又構(gòu)建了α毒素C端CPA247-370，結(jié)果它不具有鞘磷脂酶活性、溶血性和致死性。然而，當用CPA1-249和CPA247-370共同作用于小鼠紅細胞時，卻能使小鼠紅細胞發(fā)生溶血，這表明C端能將溶血活性賦予N端，但也不能否認，CPA247-370結(jié)合CPA1-249后相互作用時，CPA 247-370構(gòu)象發(fā)生變化，從而激活CPA247-370的活性位點，使其具有了酶活性。同時還證實α毒素的C端和真核細胞的一種脂質(zhì)代謝酶——花生四烯酸脂肪氧化酶N端之間有同源性，均含有5個連在一起的酪氨酸殘基，疏水性酪氨酸殘基與糖類底物識別一致。通過化學(xué)修飾研究，還證實α毒素中組氨酸殘基和鋅離子的協(xié)同作用是很重要的，鋅離子結(jié)合在組氨酸殘基上[24]。

Nagahama等[25]構(gòu)建了α毒素N端CPA1-250和C端CPA251-370，并研究了它們在α毒素生物學(xué)活性中的作用。產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素N端CPA1-250和蠟樣芽胞桿菌磷脂酶C（BcPLC）一樣都具有磷脂酶C活性，但前者不能結(jié)合兔紅細胞，也不能裂解兔紅細胞。由BcPLC和C端CPA251-370構(gòu)建的雜合蛋白BC-CPA251-370能結(jié)合在紅細胞上且能裂解紅細胞。N端CPA1-250和C端CPA251-370在一起孵育后能夠?qū)崿F(xiàn)完全互補且具有溶血活性和磷脂酶C活性，C端CPA251-370也能賦予BcPLC溶血活性。C端CPA251-370能夠顯著激活N端CPA1-250的磷脂酶C活性。進一步研究表明，C端CPA251-370對N端CPA1-250的相互作用顯示，可以誘導(dǎo)N端CPA1-250的結(jié)構(gòu)改變，但是不能賦予N端CPA1-250溶血活性。動力學(xué)分析表明，C端CPA251-370能提高對底物N端CPA1-250的的親和力。作者使用熒光標記C端CPA251-370實驗首次證實，C端CPA251-370可以插入細胞膜脂質(zhì)雙層，能夠引起N端CPA1-250接近磷脂酰膽堿，導(dǎo)致N端CPA1-250水解膜內(nèi)的磷脂酰膽堿和破壞細胞膜。上述實驗結(jié)果表明，C端CPA251-370在結(jié)合紅細胞以及N端CPA1-250的溶血活性和酶活性方面發(fā)揮非常重要的作用。

Williamson等[26]克隆表達了CPA1-249和CPA 247-370，這2種產(chǎn)物的生物學(xué)效應(yīng)有所不同。CPA1-249免疫動物后產(chǎn)生的抗體能中和α毒素的磷脂酶C活性，但不能中和α毒素的溶血活性。CPA247-370免疫動物后產(chǎn)生的抗體既能中和α毒素的磷脂酶C活性，也能中和α毒素的溶血活性，而且CPA247-370免疫鼠可抵抗至少10 LD100劑量的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒。這些試驗結(jié)果充分說明，α毒素確實由2個區(qū)域組成，N端具有磷酯酶C活性，C端具有鞘磷脂酶活性，只有兩者協(xié)同作用，才具有溶血活性和致死活性。單獨α毒素N端CPA1-249和C端CPA247-370的毒性很低，但其免疫動物后產(chǎn)生的抗血清中和效果不同，這是由于CPA247-370在單獨表達后，形成的高級結(jié)構(gòu)與α毒素完整結(jié)構(gòu)相似，故能中和α毒素的溶血活性和致死活性，表明α毒素的保護性抗原為其C端。如果是后者，C端在調(diào)控酶活性方面將起著重要作用[27-28]?？傊?，α毒素可能由2個功能區(qū)組成，N端具有磷脂酶C活性，C端具有鞘磷脂酶活性，然而僅依靠磷脂酶C活性不足以使α毒素具有毒性。α毒素C端表現(xiàn)溶血特性，如果去除α毒素的C端，就會大大降低鞘磷脂酶活性，但檢測不到α毒素的溶血性和致死性，可能是這些區(qū)域使蛋白質(zhì)發(fā)生了構(gòu)型改變，易于和細胞膜發(fā)生反應(yīng)的緣故。

綜上所述，近年來關(guān)于產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的研究報道，主要側(cè)重于α毒素基因的定點基因突變、α毒素N端和C端生物學(xué)功能，以及α毒素與靶細胞作用方式等方面，而關(guān)于產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、致病機制，以及α毒素在5種毒素型（A、B、C、D、E）產(chǎn)氣莢膜梭菌中的致病作用還需要進行深入細致研究，這對于闡明產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制和致病機制具有重要的理論意義和實踐價值。

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