夏姍 ，武福軍 ，趙洪亮 ，薛沖 ，劉志敏

1.安徽大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230039；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100071；3.山西康寶生物制品股份有限公司，山西 長治 046000

20世紀(jì)80年代以來，隨著生物技術(shù)藥物在人類疾病治療和預(yù)防中的廣泛應(yīng)用，大大加速了微生物細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。近20年來，畢赤酵母大規(guī)模培養(yǎng)已成為生物制藥領(lǐng)域非常重要的關(guān)鍵技術(shù)之一，并不斷推動生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)在表達(dá)外源蛋白方面具有非常明顯的優(yōu)勢，這是因為畢赤酵母本身為單細(xì)胞真核生物，易于分子遺傳學(xué)操作，且外源基因可以整合到酵母的染色體上，隨染色體一起復(fù)制和遺傳，不易造成外源基因的丟失現(xiàn)象；具有強(qiáng)誘導(dǎo)性和強(qiáng)啟動性的醇氧化酶基因啟動子，適用于外源基因的高水平誘導(dǎo)表達(dá)；并且畢赤酵母在高水平表達(dá)外源蛋白的同時，自身背景蛋白分泌卻很少，不需要破菌等復(fù)雜操作，有利于后續(xù)純化；畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)物的積累不會對自身宿主菌產(chǎn)生大的毒副作用，這更有利于大規(guī)模的高密度發(fā)酵。目前，越來越多的國內(nèi)外研究者選擇畢赤酵母作為外源蛋白的優(yōu)先表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)產(chǎn)物包括干擾素、白介素2、抗體等[1-3]，且已有產(chǎn)品上市。盡管畢赤酵母有自身的優(yōu)點(diǎn)，但對于不同的具體目標(biāo)產(chǎn)品，表達(dá)水平參差不齊。如胞內(nèi)分泌表達(dá)的巴西三葉膠腈水解酶的產(chǎn)量高達(dá)22 g/L[4]，破傷風(fēng)片段C產(chǎn)量高達(dá)12 g/L[5]，胞外分泌表達(dá)的明膠的產(chǎn)量達(dá)到14.8 g/L[6]等，而最低的報道只有1 mg/L，其間相差可達(dá)10 000倍。因此，要提高目的蛋白的表達(dá)水平，高密度發(fā)酵（high-density fermentation）也成為一個關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)。

1 畢赤酵母工程菌的選擇和改良

1.1 工程菌的選擇

目前畢赤酵母工程菌株常常呈現(xiàn)2種表型，分別為mut+和muts，aox1基因缺失的酵母在甲醇限制性培養(yǎng)基上生長緩慢（methanol utilization slow，muts或mut-），它們只能利用弱的aox2基因啟動合成醇氧化酶（AOX），而aox1基因完整的酵母則生長正常（mut+）。目前這2種表型的畢赤酵母菌株在高密度大規(guī)模表達(dá)時均有使用，主要根據(jù)具體的外源蛋白來選擇，如根據(jù)表達(dá)產(chǎn)物的分子大小、降解產(chǎn)物的多少、蛋白折疊程度等性質(zhì)選擇工程菌的表型。如考慮到后續(xù)產(chǎn)品的制備，一般選用無缺陷的mut+菌株，對外源蛋白適用性好，便于發(fā)酵控制[7]；如果是胞內(nèi)表達(dá)，應(yīng)盡量用muts菌株，這樣得到的蛋白產(chǎn)物中AOX較少而目的蛋白量相對較多（占畢赤酵母總分泌蛋白量的30%～90%，使下游純化更易進(jìn)行[8]）。

1.2 對重組轉(zhuǎn)化子的篩選

為了獲得高產(chǎn)量的表達(dá)菌株，就需要對大量轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選，這就要求人們在考察菌體對表達(dá)產(chǎn)物表達(dá)水平的同時，也要考慮到該表達(dá)系統(tǒng)對表達(dá)產(chǎn)物的影響。如果工程菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)產(chǎn)物容易降解或易受培養(yǎng)基成分的影響，需要考慮表達(dá)產(chǎn)物是選擇分泌表達(dá)還是細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。

2 培養(yǎng)基的設(shè)計和優(yōu)化

目前在畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的培養(yǎng)過程中，主要使用不同大小的生物反應(yīng)器，采取補(bǔ)料-分批發(fā)酵（fed-batch）工藝，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)相、流加補(bǔ)料相（進(jìn)一步提高菌體密度）和誘導(dǎo)表達(dá)相的三相發(fā)酵，而高密度發(fā)酵培養(yǎng)主要是通過基礎(chǔ)培養(yǎng)相來實現(xiàn)菌種的生長、增殖，再通過流加補(bǔ)料相進(jìn)一步使菌體大量增殖與累積，從而達(dá)到高密度菌體。

2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的選擇

補(bǔ)料-分批培養(yǎng)中的培養(yǎng)基的組分直接影響細(xì)胞的生長和外源基因的表達(dá)。在畢赤酵母高密度培養(yǎng)時，培養(yǎng)基主要包括BMGY/BMMY、BMG/BMM和BSM，也有部分使用MGY/MMY培養(yǎng)基?；A(chǔ)鹽培養(yǎng)基（BSM）在低pH值條件下處于溶解狀態(tài)，但在高pH值條件下易產(chǎn)生鹽沉淀，所以在生產(chǎn)時一般使用低濃度的鹽或優(yōu)化后的培養(yǎng)基。BMGY/BMMY、BMG/BMM培養(yǎng)基中包含磷酸鹽緩沖液，可以維持培養(yǎng)基中的pH值保持相對恒定，適用于對pH值敏感的表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)，但由于培養(yǎng)基組分和多步操作，在生產(chǎn)中容易引起污染。由于表達(dá)產(chǎn)物的特殊性和多樣性，在分批培養(yǎng)過程中需要對培養(yǎng)基進(jìn)行篩選和優(yōu)化。另外，為了保護(hù)目的產(chǎn)物的活性和不被降解，須在培養(yǎng)基中添加蛋白酶抑制劑或EDTA等保護(hù)劑，以降低蛋白酶對表達(dá)產(chǎn)物的降解[9]。

2.2 補(bǔ)料培養(yǎng)基的補(bǔ)加方式

目前畢赤酵母發(fā)酵過程中的補(bǔ)料培養(yǎng)基主要成分為葡萄糖和甘油，含誘導(dǎo)型啟動子的菌株一般在甲醇和甘油或甲醇和葡萄糖的培養(yǎng)基中生長[10]；而組成型啟動子［如甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）基因的啟動子］則可以不需要甲醇的誘導(dǎo)在含葡萄糖的培養(yǎng)基中正常生長[11]。葡萄糖作為碳源性價比較高，有利于工業(yè)化生產(chǎn)；甘油作為畢赤酵母的碳源，效果優(yōu)于葡萄糖，但其濃度過高和過低均會影響菌體的生長。為了實現(xiàn)菌體高密度發(fā)酵的同時又有利于大規(guī)模生產(chǎn)，許多研究者對補(bǔ)料方式做了深入細(xì)致的研究，主要包括間歇式補(bǔ)料發(fā)酵、恒速流加補(bǔ)料發(fā)酵、指數(shù)流加發(fā)酵及在不同時期綜合考慮的流加方式[12]。間歇式補(bǔ)料發(fā)酵是最常見的流加發(fā)酵方式，即每隔一段時間補(bǔ)料一次；恒速流加補(bǔ)料發(fā)酵，以恒定流速補(bǔ)加培養(yǎng)基，直到誘導(dǎo)表達(dá)開始；指數(shù)流加發(fā)酵是隨微生物生長同步補(bǔ)加的方式，在一定范圍內(nèi)菌體量隨時間以指數(shù)函數(shù)增加，所以流加補(bǔ)料也隨時間以指數(shù)函數(shù)增加，這種流加需要對菌體的生長速率有準(zhǔn)確的把握，其生長速率的大小也會影響菌體的生長。Cunha等在研究scFv受體片段的發(fā)酵過程中，發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)階段細(xì)胞濃度和甲醇的攝取率是對表達(dá)量影響最大的因素[13]。在規(guī)?；笊a(chǎn)過程中，補(bǔ)料方式的選擇要綜合考慮生產(chǎn)成本和菌體增殖，同時要考慮到補(bǔ)料對目的表達(dá)產(chǎn)物的影響。目前有研究采用時間分段，各段采用不同的補(bǔ)加方式，既有利于菌體的生長又有利于培養(yǎng)基的完全利用。

3 發(fā)酵過程控制

目前，對畢赤酵母的高密度發(fā)酵培養(yǎng)的過程控制策略呈多樣化，比如對影響菌體生長的各個因素的控制、對細(xì)胞生長速率的控制、反饋控制和對培養(yǎng)基成分濃度的控制等，但各控制之間關(guān)聯(lián)因素多，無法形成一個合理的模型控制，需要進(jìn)一步探索。

3.1 發(fā)酵過程參數(shù)的控制

3.1.1 溶氧的控制 對于畢赤酵母而言，發(fā)酵培養(yǎng)中的溶解氧是影響生長表達(dá)的關(guān)鍵因素。高密度發(fā)酵需要消耗大量氧氣，尤其在菌體快速生長期間，供氧往往成為菌體大量生長的限制因素，保證氧氣的供給成為高密度發(fā)酵的重要因素。培養(yǎng)基中溶解氧的提高主要受通氣量、攪拌速度、罐壓的直接影響，

以及溫度、補(bǔ)料速度等的間接影響，因此溶解氧可以反映出菌體生長情況。為了提高溶解氧的濃度，生產(chǎn)上開始采用純氧和空氣按一定比例混合通氣的方式來提高供氧能力，盡力解決由于缺氧帶來的限制。但是，也有研究表明氧濃度太高會抑制菌體的生長和繁殖[14]。

3.1.2 溫度的控制 溫度對菌體的生長和發(fā)酵的影響是各種因素綜合表現(xiàn)的結(jié)果。溫度對畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)物的活性、發(fā)酵液的物理性質(zhì)（溶解氧量、基質(zhì)的分解吸收速率等）及生物合成方向等都有影響。溫度升高，有利于生長代謝和蛋白表達(dá)，但溫度過高反而會使菌體過早衰老，發(fā)酵周期縮短，蛋白表達(dá)量和活性降低，表達(dá)產(chǎn)物的產(chǎn)量受到影響。因此，必須選擇合適的溫度，而且在不同的階段應(yīng)選擇不同的溫度，采用變溫發(fā)酵。菌體生長最適溫度為28～30℃，這有利于菌體大量而快速生長；誘導(dǎo)表達(dá)的最適溫度應(yīng)適當(dāng)降低，降低溫度也可以緩減溶氧的壓力，這樣有利于蛋白的表達(dá)，同時低溫有利于蛋白的正確折疊，提高蛋白穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)期間降低溫度，在提高目的產(chǎn)物累積的同時，也可以減少菌體的凋亡和保護(hù)目的表達(dá)產(chǎn)物不被降解[15]。

3.1.3 pH值的控制 pH值是發(fā)酵體系中的重要化學(xué)參數(shù)，它不僅與菌體的生長有關(guān)，而且和目的表達(dá)產(chǎn)物的合成也有關(guān)系。目前在畢赤酵母工程菌發(fā)酵生產(chǎn)過程中，一般采用變調(diào)pH值的辦法來控制菌種的生長和目的表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)。畢赤酵母在pH3～7的條件下均可以生長，范圍比較寬泛。但考慮到菌體細(xì)胞膜的性質(zhì)，以及工程菌的生長過程會產(chǎn)生各種代謝產(chǎn)物，而它們會對工程菌后期誘導(dǎo)表達(dá)相產(chǎn)生重要影響，因此，pH值在發(fā)酵生產(chǎn)過程中一般控制在4～6，這樣既可以使菌體正常生長，又可以緩解代謝副產(chǎn)物對菌體的抑制性影響[16]。在高密度發(fā)酵表達(dá)過程中，為了保證目的表達(dá)產(chǎn)物的生物活性，防止被蛋白酶降解，必須選擇合適的pH值；另一方面，最適pH值的選擇應(yīng)盡量偏離目的表達(dá)產(chǎn)物的等電點(diǎn)。由于在誘導(dǎo)表達(dá)期間，菌體的代謝較快，pH值的變化也會變快，所以要維持恒定的pH值就必須使用酸堿調(diào)節(jié)劑來調(diào)節(jié)，在工業(yè)生產(chǎn)中一般選用氨水，同時又可以補(bǔ)充菌體生長和表達(dá)目的產(chǎn)物所必需的氮源。

3.2 反饋控制

3.2.1 根據(jù)發(fā)酵體系內(nèi)菌體比生長率控制 依據(jù)細(xì)胞數(shù)量與光密度的關(guān)聯(lián)性，營養(yǎng)物質(zhì)消耗與活細(xì)胞密度積分之間化學(xué)計量比例關(guān)系及菌體的比生長速率（μ）可以反映菌體生物量和菌體的生長狀態(tài)。在菌體快速生長階段，可以根據(jù)菌體的比生長速率來調(diào)節(jié)補(bǔ)料的速度和方式，從而使菌體在短時間內(nèi)達(dá)到快速增殖，這樣既節(jié)省了發(fā)酵時間，同時又達(dá)到了快速積累高密度菌體的目的。當(dāng)畢赤酵母工程菌進(jìn)入誘導(dǎo)表達(dá)階段時，通過對生物反應(yīng)器流加誘導(dǎo)劑，使菌體快速表達(dá)目的產(chǎn)物；但此時最理想的發(fā)酵控制狀態(tài)，還應(yīng)該保持工程菌一定的比生產(chǎn)速率，從而使目的產(chǎn)物的表達(dá)量不致于降低。

3.2.2 依據(jù)發(fā)酵體系內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)濃度變化控制 通過測定發(fā)酵體系中某些營養(yǎng)物質(zhì)的濃度，以此為依據(jù)來調(diào)節(jié)流加補(bǔ)料的體積、速度、時間及補(bǔ)料方式。目前，通過離線檢測或在線檢測不同營養(yǎng)物質(zhì)的濃度變化來反映菌體的生長情況，從而采取相應(yīng)的策略調(diào)整發(fā)酵過程中的參數(shù)和補(bǔ)料情況。如檢測培養(yǎng)液中的甘油（或葡萄糖）的含量和菌體的生長情況來綜合分析與評價，做出相應(yīng)的調(diào)節(jié)；再如通過檢測培養(yǎng)基中甲醇濃度來調(diào)節(jié)甲醇流加的速度等。但這種調(diào)控策略的生產(chǎn)成本較高，還沒有得到廣泛應(yīng)用[17]。

過程優(yōu)化是發(fā)酵工程的基本問題，其目的是最大限度地提高目標(biāo)產(chǎn)品的生產(chǎn)效率。隨著計算機(jī)技術(shù)在發(fā)酵工程領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，以及各種電極和檢測技術(shù)的發(fā)展，人們正不斷嘗試把計算機(jī)技術(shù)、檢測手段、各種數(shù)學(xué)算法及理論應(yīng)用于發(fā)酵工程過程控制與優(yōu)化領(lǐng)域中[18]，如遺傳算法、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)控制理論、模糊控制理論等已運(yùn)用于培養(yǎng)基的優(yōu)化、數(shù)學(xué)模型的參數(shù)估算及最優(yōu)控制軌跡計算等。近年來，這些先進(jìn)的理論和技術(shù)也逐漸被運(yùn)用到發(fā)酵產(chǎn)品的生產(chǎn)實踐中去。

4 結(jié)語

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)作為一種低等真核表達(dá)系統(tǒng)，具有諸多優(yōu)點(diǎn)，適合于工業(yè)化大規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)，相信隨著研究的深入和應(yīng)用的廣泛，其在生物制藥領(lǐng)域?qū)l(fā)揮越來越重要的作用。但目前來看還存在一些問題，例如在高密度菌體發(fā)酵的條件下如何在提高目的產(chǎn)物高效表達(dá)的同時，找到有效防止目的產(chǎn)物降解的辦法；采用何種補(bǔ)料方式，既能滿足菌體的生長，又可為基因表達(dá)提供足夠的動力；以及如何避免在生產(chǎn)過程中潛在的安全問題等。

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