周良彬，雷航，譚文佳，陳俊鵬，周曉，余曉麗

武漢工業(yè)學院 生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023

隨著細胞凋亡檢測技術的不斷發(fā)展和日漸成熟，細胞凋亡檢測的實驗室教學也顯得頗為重要。然而，用于科學研究的檢測方法由于耗材、耗時、操作繁瑣等原因不適合實驗教學，所以研究如何快速誘導細胞凋亡，建立經(jīng)濟、簡便、快速的檢測細胞凋亡的實驗室教學方法是目前實驗教學中亟待解決的問題。細胞凋亡的誘導因素主要有物理因素、化學因素及生物因素。物理因子包括射線、水澇[1]、高滲、機 械 脅 迫 等 ；化 學 因 子 有H2O2[2]、營 養(yǎng) 因 子[3]、NaCl、AlCl3、CaCl2等鹽溶液[4-7]；生物因子涵蓋激素、細胞生長因子等。我們選擇NaCl、CaCl2脅迫誘導法進行細胞凋亡的快速誘導，操作簡便、經(jīng)濟，更適用于實驗室教學。采用甲基綠-派諾寧試劑可對動、植物細胞進行細胞凋亡的快速檢測，凋亡細胞核染成藍綠色，細胞質(zhì)染成紅紫色。

1 材料與方法

1.1 材料

洋蔥鱗莖內(nèi)表皮、大蒜根尖、雞血。

離子脅迫誘導溶液：NaCl、無水CaC12、蒸餾水。

雞血紅細胞處理液：0.75%生理鹽水、Hanks液。

甲基綠-派諾寧試劑：2%甲基綠水溶液6 mL、5%派諾寧水溶液2 mL、0.1 mol/L醋酸鹽緩沖液（pH4.8）（0.1 mol/L醋酸 40 mL，0.1 mol/L醋酸鈉60 mL）16 mL、蒸餾水 16 mL，臨用時混合，存于冰箱中，可用數(shù)次。

1.2 離子脅迫誘導法探討最佳誘導濃度

取新鮮洋蔥在室溫下于清水中培養(yǎng)數(shù)小時，使其活化。自培養(yǎng)好的洋蔥鱗莖上切取1 cm2左右的內(nèi)表皮若干，洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細胞經(jīng)0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L共5個不同濃度梯度的NaCl、CaCl2離子脅迫處理2 h后，用顯微鏡觀察其形態(tài)變化。

1.3 離子脅迫誘導法探討最適誘導時間

取新鮮洋蔥在室溫下于清水中培養(yǎng)數(shù)小時，使其活化。自培養(yǎng)好的洋蔥鱗莖上切取1 cm2左右的內(nèi)表皮若干，用0.4 mol/L的CaC12溶液誘導，誘導時間分別為 2、4、6、8、10、12、14 h，用光學顯微鏡觀察凋亡細胞的形態(tài)學變化并計數(shù)。

1.4 甲基綠-派諾寧染色法檢測洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細胞的凋亡

1.4.1 洋蔥鱗莖內(nèi)表皮預處理及凋亡誘導 取新鮮洋蔥在室溫下于清水中培養(yǎng)數(shù)小時，使其活化。從培養(yǎng)好的洋蔥鱗莖上切取1 cm2左右的內(nèi)表皮若干，分成3組。第1組正對照，為正常細胞；第2組試驗組，于0.4 mol/L的CaCl2溶液中培養(yǎng)8 h得到的凋亡細胞；第3組負對照，為煮沸5 min的壞死細胞。

1.4.2 染色與鏡檢 將上述3組處理后的材料分別用甲基綠-派諾寧染色15～20 min，然后制片鏡檢觀察，比較,各組細胞的形態(tài)特征和顏色變化并拍照。

1.5 甲基綠-派諾寧染色法檢測大蒜根尖細胞的凋亡

1.5.1 大蒜根尖的預處理及凋亡誘導 取新鮮大蒜在室溫下于清水中培養(yǎng)數(shù)天，使其長出新根。將長出新根的大蒜剪下根尖長約1 cm，分成3組。第1組正對照，為正常細胞；第2組試驗組，于0.4 mol/L的CaCl2溶液中培養(yǎng)8 h得到的凋亡細胞；第3組負對照，為煮沸5 min的壞死細胞。

1.5.2 染色與鏡檢 將上述3組分別用甲基綠-派諾寧染液染色15～20 min，然后制片壓片（注意壓片適當，使細胞充分分開），鏡檢觀察，比較各組細胞的形態(tài)特征和顏色變化并拍照。

1.6 甲基綠-派諾寧染色法檢測雞血紅細胞的凋亡

1.6.1 雞血紅細胞的預處理及誘導凋亡 取新鮮的雞血懸浮液3 mL左右，以4500 r/min離心5 min，棄上清液，加Hanks液，混勻，制成10%的雞血細胞懸浮液。分別向3只小燒杯中加入上述懸浮液1 mL，向其中一只中滴加1 mL 0.4 mol/L的CaCl2溶液，靜置8 h；向另一只中滴加0.75%生理鹽水1 mL；向最后一只中滴加0.75%生理鹽水1 mL，紫外線照射約20 min。

1.6.2 染色與鏡檢 取一滴10%的雞血細胞懸浮液于載玻片上，滴加一滴甲基綠-派諾寧染液，靜置15～20 min，用濾紙吸去染液，在酒精燈旁烘干固定（或用吹風機吹干），用水慢慢沖洗裝片上的染液（水流不宜過激），再用吸水紙吸去載玻片上的水分，在酒精燈旁烘干固定（或用吹風機吹干）。鏡檢觀察，比較各組細胞的形態(tài)特征和顏色變化并拍照。

2 結(jié)果

2.1 離子脅迫最佳誘導濃度

據(jù)實驗觀察，經(jīng)0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L濃度梯度的NaCl、CaCl2離子脅迫處理后均能誘導細胞凋亡，但凋亡的程度不同。表1簡要描述了經(jīng)不同濃度離子處理8 h后的細胞形態(tài)。

用不同濃度離子處理洋蔥鱗莖內(nèi)表皮后，取樣并制片，每種處理各選取3個視野，統(tǒng)計總細胞數(shù)和凋亡細胞數(shù)（以細胞核染色質(zhì)出現(xiàn)明顯的邊緣化凝集為標志），計算凋亡率［凋亡率（%）=（凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)）×100%］。以離子濃度為x軸、凋亡率為y軸，繪制誘導離子濃度與凋亡率之間的關系圖（圖1），可以看出，采用離子脅迫誘導法時，離子脅迫誘導劑濃度為0.4 mol/L有較高的凋亡率，且CaCl2的誘導效果較NaCl好。

2.2 離子脅迫最適誘導時間

誘導1 h未出現(xiàn)凋亡小體，隨著誘導時間的延長，凋亡細胞的數(shù)目逐漸增加，誘導5 h時明顯出現(xiàn)凋亡小體，若繼續(xù)延長處理時間，凋亡現(xiàn)象更加明顯，但同時壞死細胞數(shù)量也大大增加，出現(xiàn)細胞膜破損、細胞核裂解、細胞內(nèi)含物外泄等現(xiàn)象，不能保持細胞完整性。

表1 5種不同濃度離子處理8 h后的細胞凋亡形態(tài)學描述

圖1 誘導劑濃度與凋亡關系曲線

用不同時間梯度誘導洋蔥鱗莖內(nèi)表皮后，取樣并制片，每種處理各選取3個視野，統(tǒng)計總細胞數(shù)和凋亡細胞數(shù)（以細胞核染色質(zhì)出現(xiàn)明顯的邊緣化凝集為標志），計算凋亡率［凋亡率（%）=（凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)）×100%］。以離子濃度為x軸、凋亡率為y軸，繪制誘導時間與凋亡率之間的關系圖（圖2），可以看出，采用離子脅迫誘導法時，誘導8 h左右有較高的凋亡率。

2.3 甲基綠-派諾寧染色法檢測洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細胞凋亡

對比圖3A、B可知，經(jīng)甲基綠-派諾寧染色后，凋亡細胞的細胞核染成紅色，細胞質(zhì)部分染成淺紅色，細胞質(zhì)壁分離現(xiàn)象明顯，細胞質(zhì)高度濃縮，細胞核內(nèi)出現(xiàn)泡狀結(jié)構(gòu)，且某些細胞的細胞核消失，形成大量凋亡小體；死亡細胞經(jīng)甲基綠-派諾寧染色后，其細胞核呈藍色，細胞質(zhì)無色。

2.4 甲基綠-派諾寧染色法檢測大蒜根尖細胞凋亡

對比圖4A、B可知，經(jīng)甲基綠-派諾寧染色后，凋亡細胞的細胞核染成紅色，細胞質(zhì)部分染成紅色，且出現(xiàn)明顯的質(zhì)壁分離，部分細胞核呈不規(guī)則狀；死亡細胞經(jīng)甲基綠-派諾寧染色后，細胞核呈藍色，細胞質(zhì)無色。

2.5 甲基綠-派諾寧染色法檢測雞血紅細胞凋亡

對比圖5A、B可知，經(jīng)甲基綠-派諾寧染色后，凋亡細胞的細胞核染成藍色，細胞質(zhì)染成紅色；壞死細胞經(jīng)甲基綠-派諾寧染色后，細胞核呈紅色。

圖2 誘導時間與凋亡率的關系曲線

圖3 Ca2+脅迫誘導洋蔥鱗莖細胞的凋亡

3 討論

3.1 影響本實驗的因素

本實驗采用3種不同實驗材料進行細胞凋亡的檢測，洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細胞的結(jié)果最好，原因在于其細胞較大，且為單層細胞結(jié)構(gòu)，因而容易觀察。大蒜根尖細胞排列較緊密，且是多層排列，故不宜分散。雞血紅細胞易分散，但細胞較小，故難以觀察，且容易凝集和破裂，難以對其做壞死處理。

凋亡現(xiàn)象的發(fā)生與誘導時間之間有著十分重要的關系。誘導2 h，染色現(xiàn)象并不明顯，誘導8 h時染色明顯。誘導劑的濃度也應適當，過高或過低都會對實驗造成影響。誘導劑濃度過低，凋亡不明顯；濃度過高，會使細胞繼發(fā)性壞死。

染色時間對實驗結(jié)果也有很大影響，染色時間短時現(xiàn)象不明顯，染色時間過長也會對實驗結(jié)果造成干擾。

3.2 Ca2+和Na+脅迫誘導細胞凋亡的可能機理

Ca2+和Na+等離子脅迫劑能刺激線粒體外膜上的受體，使線粒體膜通透性改變孔（mitochondrion permeability transition pore，PT孔）不可逆性開放，線粒體跨膜電位消失，通透性增高，從而導致細胞色素C、凋亡誘導因子等促凋亡物質(zhì)的釋放，最終導致細胞凋亡[8]。

圖4 Ca2+脅迫誘導大蒜根尖細胞的凋亡

圖5 Ca2+脅迫雞血紅細胞的凋亡

目前的研究表明，在許多細胞凋亡過程中，都伴隨胞內(nèi)自由Ca2+的大幅增加，特別是在凋亡早期，Ca2+往往表現(xiàn)出急劇增加，提示Ca2+可能是啟動細胞凋亡的早期信號[9]。細胞內(nèi)、外的一些凋亡因子，可能激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體上的鈣通道，使其中的Ca2+大量釋放，并打開質(zhì)膜上的鈣通道，使胞外Ca2+內(nèi)流，導致細胞質(zhì)內(nèi)Ca2+增加，進而誘導細胞凋亡[10]。而Ca2+依賴性的凋亡信號途徑又可以被高鹽（NaCl）所誘導。本實驗中，CaCl2中的Ca2+可能通過細胞質(zhì)膜上的鈣通道進入細胞質(zhì)，使細胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度急劇增加，從而高效誘導細胞凋亡。并且，Ca2+還能激活相應的核酸內(nèi)切酶及參與凋亡相關信號的轉(zhuǎn)導等。因此，CaCl2對凋亡的誘導效率比單純的鹽脅迫劑NaCl略高。

3.3 甲基綠-派諾寧對凋亡細胞染色的機理

細胞凋亡和壞死均可表現(xiàn)為細胞核固縮等細胞死亡形態(tài)，但兩者的發(fā)生機制不同。細胞凋亡是一種細胞主動死亡過程，需要細胞內(nèi)蛋白酶的激活，細胞質(zhì)內(nèi)常有mRNA表達的增強。而壞死則是一種被動的細胞死亡過程，細胞質(zhì)內(nèi)常有RNA損失。根據(jù)這一特點，可利用試劑甲基綠對DNA染色的特異性和派諾寧對RNA的親和性。甲基綠對染色質(zhì)中的DNA選擇性結(jié)合顯示綠色或藍色，派諾寧與核仁、細胞質(zhì)中的RNA選擇性結(jié)合顯示紅色。如果細胞質(zhì)內(nèi)核糖核酸呈派諾寧陽性染色（紅紫色）者為凋亡細胞，呈陰性染色（藍綠色）者為壞死細胞。

3.4 結(jié)語

我們采用離子脅迫誘導法測得誘導洋蔥鱗莖細胞凋亡的最適離子濃度為0.4 mol/L，最佳誘導時間為8 h，最佳誘導劑為CaCl2。采用甲基綠-派諾寧染色法，可檢測到洋蔥鱗莖細胞、大蒜根尖細胞、雞血紅細胞的凋亡現(xiàn)象，其中洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細胞凋亡現(xiàn)象最為明顯。該方法實驗現(xiàn)象明顯，易于觀察，操作簡便，能為實驗教學提供快捷、經(jīng)濟、準確的方案。同時，采用甲基綠-派諾寧法進行細胞凋亡的快速檢測，對于腫瘤、宮頸糜爛等疾病的檢測也有一定的臨床應用價值。

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