李慧瑾，李研，孫晶瑩，高錦偉，趙向絨，封青，譚天天，胡巧俠，李元，胡軍

陜西省人民醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710068

新型甲型H1N1流感是一種由人、豬、禽三源重組的新型病毒株引起的急性呼吸道傳染性疾病，具有人群普遍易感、發(fā)病快、傳播蔓延迅速、并發(fā)癥嚴(yán)重等特點(diǎn)[1-4]。甲型H1N1流感已給全球人類的健康和經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來了較大的負(fù)面影響。接種甲流疫苗是預(yù)防甲流大流行的有效手段之一，但接種疫苗后少數(shù)不良事件的發(fā)生，仍使人們對(duì)疫苗的安全性產(chǎn)生了質(zhì)疑[5-8]。目前接種的甲流疫苗主要成分為甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白。如果能對(duì)甲型流感病毒血凝素蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入研究，對(duì)分析抗原決定簇的氨基酸位點(diǎn)、后續(xù)甲流疫苗的改造及提高甲流疫苗的安全性具有重要意義。我們針對(duì)甲型H1N1流感病毒血凝素單克隆抗體，應(yīng)用巢式PCR方法，從分泌流感抗體的雜交瘤細(xì)胞中擴(kuò)增抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)基因并進(jìn)行測(cè)序，為下一步分析抗體與抗原的結(jié)合靶位提供基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存；6株甲型H1N1流感病毒血凝素單克隆抗體A1-6、A1-8、A1-12、H1-4、H1-13和H1-28由本實(shí)驗(yàn)室制備，抗體輕鏈亞型均為κ鏈；總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購自北京天根生物公司；ExTaq聚合酶、rTaq聚合酶、限制性內(nèi)切酶、pMD19-T載體、DNA marker購自大連TaKaRa公司；IPTG、X-Gal、氨芐西林購自 Sigma公司；Fluor Chem FC2凝膠成像系統(tǒng)購自Alpha Inno?tech公司；引物合成和測(cè)序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

1.2 總RNA的提取制備及cDNA的合成

將分泌上述抗體的雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)，收集生長狀態(tài)良好的雜交瘤細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)約為1×106/mL。提取總RNA，以提取的RNA為模板，用天根公司的cDNA第一鏈試劑盒合成cDNA。

1.3 抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)基因的引物設(shè)計(jì)

比對(duì)鼠抗體Kabat數(shù)據(jù)庫中所有小鼠免疫球蛋白κ輕鏈和重鏈可變區(qū)核苷酸序列，針對(duì)6個(gè)家族的輕鏈，設(shè)計(jì)擴(kuò)增輕鏈可變區(qū)（VL）的擴(kuò)增引物共7對(duì)，上游從FWR1區(qū)起始，設(shè)計(jì)P1～P7，下游至FWR4區(qū)，設(shè)計(jì)通用引物P8。根據(jù)5個(gè)家族的重鏈基因，設(shè)計(jì)擴(kuò)增重鏈可變區(qū)（VH）的引物5對(duì)，上游引物始于FWR1區(qū)，分別為P9～P13，下游至FWR4區(qū)，設(shè)計(jì)引物P14。擴(kuò)增引物序列及家族分類見表1。設(shè)計(jì)輕鏈鑒定引物 5對(duì)，分別為 P1-P15、P2-P16、P3-17、P4-17、P5-P18、P7-P19，上游從FWR1區(qū)起始，下游至FWR3區(qū)的第55～63位氨基酸殘基。輕鏈鑒定引物的家族分類及序列見表2。設(shè)計(jì)重鏈鑒定引物5對(duì) ，分 別 為 P20-P14、P21-P14、P22-14、P23-14、P24-P14，上游從FWR3區(qū)第66～72位氨基酸殘基起始，下游至FWR4區(qū)。重鏈鑒定引物的家族分類及序列見表3。

1.4 抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)基因的克隆

以提取的cDNA為模板，用設(shè)計(jì)的兼并引物P1～P8擴(kuò)增抗體的輕鏈可變區(qū)基因，用P9～P14擴(kuò)增重鏈可變區(qū)基因。輕鏈和重鏈可變區(qū)基因PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件一致。PCR體系包括10×Ex緩沖液（添加Mg2+）2.5 μL，dNTP（各 2.5 μmol/L）2 μL，上、下游引物（20 μmol/L）各 1 μL，ExTaq聚合酶 0.3 μL，cDNA 1 μL，蒸餾水 17.2 μL，總體積 25 μL。PCR 反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。

用對(duì)應(yīng)的鑒定引物，采用巢式PCR方法鑒定PCR擴(kuò)增的輕鏈可變區(qū)基因（輕鏈鑒定陽性目的條帶約180 bp，重鏈鑒定為陽性的條帶約150 bp），然后將PCR得到的輕鏈可變區(qū)基因和重鏈可變區(qū)基因片段膠回收，與pMD19-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取6～8個(gè)克隆進(jìn)行菌液PCR及提質(zhì)粒酶切鑒定。

1.5 菌落PCR鑒定目的基因片段

PCR擴(kuò)增目的條帶（94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min），取10 μL反應(yīng)液，以1.5 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。

1.6 DNA序列測(cè)定與分析

將鑒定陽性的克隆送北京華大基因公司進(jìn)行序列測(cè)定。用DNAMAN和BLAST軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析。

表1 輕鏈和重鏈可變區(qū)基因擴(kuò)增引物

表2 輕鏈可變區(qū)基因鑒定引物

表3 重鏈可變區(qū)基因鑒定引物

2 結(jié)果

2.1 抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)基因的克隆

分別以RT-PCR合成的cDNA為模板，利用針對(duì)抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)的12對(duì)引物，對(duì)6株抗體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最終成功地從各分泌雜交瘤的細(xì)胞系中擴(kuò)增出目的基因。各抗體擴(kuò)增成功對(duì)應(yīng)的引物見表4。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果如圖1所示，VL基因約320 bp，VH基因約350 bp。

2.2 抗體VL和VH基因克隆及篩選

將抗體VL和VH基因分別克隆至pMD19-T載體，經(jīng)菌落PCR及提取質(zhì)粒后酶切鑒定，獲得與目的片段大小對(duì)應(yīng)的條帶。

2.3 抗體VL和VH基因的序列分析

擴(kuò)增的抗體輕鏈基因各選擇4～6個(gè)陽性克隆、重鏈基因各選3～4個(gè)陽性克隆測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與NCBI BLAST Ig數(shù)據(jù)庫比對(duì)分析，結(jié)果表明6株抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)基因均符合小鼠免疫球蛋白可變區(qū)基因特征。以A1-12序列為例（圖2），其VL基因全長339 bp，編碼113個(gè)氨基酸殘基；VH基因全長354 bp，編碼118個(gè)氨基酸殘基。輕鏈的第23和93位、重鏈的第21和94位分別為半胱氨酸，各形成一個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵，該組二硫鍵對(duì)抗體可變區(qū)形成立體結(jié)構(gòu)起重要作用。圖2中分別標(biāo)出了抗體相應(yīng)的FWR區(qū)和CDR區(qū)。進(jìn)一步分析表明，A1-12VL和A1-12VH均屬于第Ⅲ亞型。

表4 PCR擴(kuò)增各抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)引物

圖1 6株抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)基因的PCR產(chǎn)物

3 討論

抗體基因的擴(kuò)增方法有多種，關(guān)鍵是引物設(shè)計(jì)，如基于前導(dǎo)肽序列及J序列設(shè)計(jì)引物、按照基因家族分類針對(duì)保守序列設(shè)計(jì)家族性引物等[9]。我們將Kabat數(shù)據(jù)庫中所有鼠免疫球蛋白κ輕鏈和重鏈可變區(qū)基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，根據(jù)基因家族分類并分析各家族的抗體序列的保守性，以FWR1和FWR4保守序列為基礎(chǔ)，針對(duì)6個(gè)家族的輕鏈可變區(qū)基因設(shè)計(jì)12對(duì)引物，針對(duì)5個(gè)家族的重鏈可變區(qū)基因設(shè)計(jì)10對(duì)引物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用12對(duì)擴(kuò)增引物從6株特異性雜交瘤細(xì)胞中擴(kuò)增抗體基因均能得到很好的結(jié)果。我們還用該組引物克隆到多株其他鼠源性單克隆抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)基因。因此，該組引物可作為鼠源性單克隆抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)基因PCR擴(kuò)增的通用引物，使有些單克隆抗體基因，尤其是輕鏈可變區(qū)基因克隆難的問題得以解決。

圖2 A1-12抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)基因序列

根據(jù)克隆選擇學(xué)說，帶有各種受體的免疫活性細(xì)胞克隆早已存在，抗原的作用只是選擇并激活相應(yīng)的克隆，也就是說，一種雜交瘤細(xì)胞只分泌一種特異的有功能性的單克隆抗體。我們以細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得特異性的VL和VH基因片段。在VL基因擴(kuò)增時(shí)，雖然均擴(kuò)增出特異條帶，但部分基因的條帶大小和目的片段相同，而測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)序列中位于FWR1區(qū)第23位的半胱氨酸突變?yōu)槔野彼帷Ｓ袌?bào)道，將骨髓瘤細(xì)胞SP2/0總RNA提取后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用不同引物擴(kuò)增輕鏈可變區(qū)基因，獲得的輕鏈可變區(qū)基因序列只有1個(gè)半胱氨酸，無法由鏈內(nèi)二硫鍵連接形成可變區(qū)的立體結(jié)構(gòu)[10]。本實(shí)驗(yàn)為避免輕鏈PCR獲得大量的假基因，針對(duì)各家族設(shè)計(jì)了相應(yīng)引物，對(duì)PCR獲得的可變區(qū)基因再用鑒定引物進(jìn)行PCR鑒定，此種巢式PCR方法可減少擴(kuò)增輕鏈假基因的比例。

研究表明，接種甲流疫苗是有效的[5-6]，可以增強(qiáng)易感人群的免疫力，從而形成預(yù)防甲流的有效免疫屏障，但仍有疫苗安全性的質(zhì)疑。在本研究中，我們克隆出6株甲型H1N1流感血凝素單克隆抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)基因，為后期流感病毒抗原與抗體結(jié)合位點(diǎn)的分析、疫苗的安全性分析，以及表達(dá)人源性基因工程抗體提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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