何富強++王紅霞++張志華++崔彬彬

摘要：為了研究核桃JrLFY基因的功能，利用RT-PCR技術(shù)擴增JrLFY基因ORF，設(shè)計含NdeⅠ/KpnⅠ酶切位點的引物獲得該基因CDS區(qū)片段，用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ/KpnⅠ雙酶切pRI 101-AN表達載體，利用In-Fusion技術(shù)成功構(gòu)建pRI 101-AN·JrLFY表達載體，并將該表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞，成功獲得工程菌，為其基因缺失或過表達等試驗提供技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：核桃；JrLFY基因；表達載體；工程菌

中圖分類號：S664.1；Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）08-1573-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.08.044

Construction of Expression Vector and Selection of Engineering Strains from JrLFY Gene of Juglans regia L.

HE Fu-qiang1，WANG Hong-xia2，ZHANG Zhi-hua2，CUI Bin-bin1

（1.Department of Biochemistry， Baoding University， Baoding 071000，Hebei，China；2.Mountainous Areas Research Institute， Agricultural University of Hebei， Baoding 071001，Hebei， China）

Abstract： To make clear the function of JrLFY gene， its open reading frame（ORF） was cloned by RT-PCR in this paper. Then the CDS fragment was amplified by primers containing specific enzyme sites. The purified PCR product and the plant expression vector pRI 101-AN was digested by the restricted enzyme NdeⅠ/KpnⅠ. The final expression vector pRI 101-AN·JrLFY was constructed successfully by In-Fusion technique and transferred into agrobacterium stain GV3101. The genetic engineering strains were selected successfully， which will provide the technical support for the experiment such as gene deletion and gene overexpression and so on.

Key words： Juglans regia； JrLFY gene； expression vector； engineering strains

LFY基因作為花分生組織決定中的關(guān)鍵基因[1]，不僅參與促進花分生組織的形成、維持花分生組織的正常功能、花啟動和防止花分生組織的逆轉(zhuǎn)，而且還參與花分生組織決定與發(fā)育[2]。Weigel等[3]構(gòu)建了帶有花椰菜花葉病毒啟動子35S的LFY表達載體，可在各種組織中活躍表達，在35S：LFY擬南芥植株中，LFY基因的過量表達可以使擬南芥所有側(cè)枝轉(zhuǎn)變?yōu)閱我坏幕?，并使花期大大提前。Blazquez等[4]將擬南芥LFY基因轉(zhuǎn)入其本身后，轉(zhuǎn)基因植株的側(cè)芽全部轉(zhuǎn)變?yōu)榛ㄑ?，花期提前。但不同植物LFY基因表達也有一定的差異[5]，楊樹LFY同源基因?qū)霐M南芥后花期提前，但對楊樹自身的轉(zhuǎn)基因植株開花情況影響不明顯[6]，而煙草NFLI基因在轉(zhuǎn)入擬南芥后也不能使花期提前[7]。

核桃（Juglans regia L.）屬中花發(fā)育的研究主要集中在形態(tài)觀察及生理特性研究，如謝小玉等[8]采用形態(tài)學觀察和生理生化測定相結(jié)合的方法研究了早實核桃與晚實核桃花芽生理分化階段營養(yǎng)物質(zhì)含量的差異。而與花發(fā)育相關(guān)基因在核桃屬植物上的報道很少，王正加[9]克隆了山核桃CcLFY基因并利用Real-time PCR技術(shù)檢測CcLFY在不同部位的表達情況，He等[10]利用RACE技術(shù)從早實核桃中林5號中克隆出JrLFY基因的cDNA全長，同時克隆了該基因的DNA全長，并研究了該基因的組織特異性表達[11]。葉春秀等[12]也利用RACE技術(shù)克隆了新疆早實核桃早豐的LEAFY同源基因。晚實核桃以頂花芽結(jié)果為主，幼樹生長較旺，形成花芽少，座果率較低，進入豐產(chǎn)期較晚。為了使晚實核桃提早開花結(jié)果，本研究擬克隆JrLFY基因ORF，構(gòu)建核桃JrLFY基因表達載體，旨在為JrLFY基因轉(zhuǎn)入晚實核桃，為研究基因的缺失、過量表達等打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

中林5號核桃芽采自河北德勝農(nóng)林科技集團有限公司；農(nóng)桿菌GV3101購自Biovector Science Lab公司；pRI 101-AN表達載體購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 核桃LFY同源基因的ORF獲得 以核桃雄花生理分化期中林5號核桃芽Total RNA為模板，進行逆轉(zhuǎn)錄試驗。設(shè)計引物F和R擴增JrLFY ORF片段，引物序列為：F：5′-ATGGATCCCGACCCCTTTAC-3′；R：5′-TTAGAAGGGCATGTGATCACC-3′。使用TaKaRa LA Taq？誖（Code No.DRR002A）進行PCR擴增，以期得到核桃LFY同源基因的開放閱讀框（ORF），然后進行目的片段純化及測序。

1.2.2 pRI 101-AN·JrLFY表達載體的構(gòu)建

1）Insert DNA的制備。設(shè)計含NdeⅠ/KpnⅠ酶切位點的引物，從含JrLFY基因的ORF質(zhì)粒中擴增目的基因CDS區(qū)片段。設(shè)計引物為：CDS1，5′-CACTGTTGATACATATGGATCCCGACCCCTTTACA- GC-3′；CDS2，5′-CAGAATTCGGATCCGGTACCTT- AGAAGGGCATGTGA-3′。使用PrimeSTAR？誖HS DNA Polymerase擴增。取5 μL PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收特異性條帶，將條帶命名為Insert DNA。

2）Vector DNA的制備。對pRI 101-AN表達載體進行NdeⅠ/KpnⅠ雙酶切，取5 μL PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收特異性條帶，將條帶命名為Vector DNA。

3）Insert DNA與Vector DNA的連接。使用In-FusionTM Advantage PCR Cloning Kit，將Insert DNA和Vector DNA連接，連接產(chǎn)物命名為pRI 101-AN·JrLFY，將連接產(chǎn)物取5 μL轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細胞，通過藍白斑篩選以及菌落PCR結(jié)合的方法得到陽性克隆，提取質(zhì)粒并測序。

1.2.3 農(nóng)桿菌GV3101工程菌株的鑒定 將pRI 101-AN·JrLFY表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞，通過濃度均為50 mg/mL的Kan和Rif雙抗生素篩選，然后進行菌落PCR檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃JrLFY基因的ORF獲得

根據(jù)JrLFY基因cDNA全長序列，設(shè)計引物擴增了JrLFY基因完整ORF，取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳獲得約1 100 bp的條帶（圖1）。取 40 μL純化的PCR產(chǎn)物進行PCR測序，測序結(jié)果與JrLFY基因cDNA全長序列一致。

2.2 pRI 101-AN·JrLFY表達載體的構(gòu)建

2.2.1 Insert DNA的制備 用含NdeⅠ/KpnⅠ酶切位點的引物擴增JrLFY基因CDS區(qū)片段，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，獲得一條與預期片段大小一致的條帶（圖2）。

2.2.2 Vector DNA的制備 pRI 101-AN載體可以將外源基因轉(zhuǎn)化到雙子葉植物中，并使外源基因獲得高效表達。本研究將pRI 101-AN表達載體進行NdeⅠ/KpnⅠ雙酶切，獲得Vector DNA片段，與預期片段大小一致（圖3）。

2.2.3 構(gòu)建pRI 101-AN·JrLFY表達載體 利用In-FusionTM Advantage PCR Cloning Kit，將Insert DNA和Vector DNA連接。連接產(chǎn)物pRI 101-AN·JrLFY轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，通過菌落PCR篩選陽性克隆，質(zhì)粒測序如圖4，該質(zhì)粒符合試驗要求。

2.3 農(nóng)桿菌GV3101工程菌株的鑒定

通過Kan和Rif雙抗生素篩選，獲得8個菌落進行PCR檢測，第4、5、8號泳道菌落出現(xiàn)目的條帶（圖5）。為了進一步驗證菌落的正確性，將8個菌落搖菌后接種含有Kan和Rif雙抗生素液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后再進行菌液PCR檢測，結(jié)果均出現(xiàn)目的條帶（圖6）。這表明菌液PCR比菌落PCR更靈敏可靠，這應該與搖菌后模板濃度增大有關(guān)，同時也說明含有JrLFY目的基因的農(nóng)桿菌工程菌株篩選成功。根據(jù)菌落PCR和菌液PCR的結(jié)果，將4號菌落作為工程菌株，所搖的菌液進行分裝，-70 ℃保存。

3 討論

從農(nóng)桿菌中提取質(zhì)粒，其拷貝數(shù)較低，很難像大腸桿菌那樣用酶切鑒定的方法鑒別。因此一般用菌液PCR和菌落PCR擴增進行檢測[13]，本研究將獲得的8個農(nóng)桿菌菌落分別作菌落PCR和菌液PCR，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌液PCR獲得目的條帶成功率極高，均出現(xiàn)目的條帶，這充分說明已成功獲得含有JrLFY目的基因的農(nóng)桿菌工程菌株。

植物基因工程為果樹育種開辟了一條新途徑，在果樹重要性狀遺傳改良方面具有重要意義，而高效表達載體的構(gòu)建是其中的重要環(huán)節(jié)[14]。蔡誠[15]構(gòu)建了含CaMV35S組成型啟動子和卡那霉素篩選基因的RNAi表達載體pBI121+2F，并將其成功的導入農(nóng)桿菌LBA4404中，石玉等[16]用限制性內(nèi)切酶SalⅠ、BamHⅠ將已克隆的蘋果PGIP基因定向插入到植物表達載體pWR306的ED35s啟動子和TNOS終止子中間，成功構(gòu)建了蘋果PGIP基因植物表達載體pWR306-PGIP。但在果樹乃至木本植物中植物表達載體很少，核桃中植物表達載體構(gòu)建更是未見諸報道。

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