張　艷,?！⊙?魏洪濤*,張國(guó)利

(1. 吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 口腔科, 吉林 長(zhǎng)春130033；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院11所)

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重組人β防御素 2工程菌的發(fā)酵及純化研究

張艷1,桑雪1,魏洪濤1*,張國(guó)利2

(1. 吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 口腔科, 吉林 長(zhǎng)春130033；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院11所)

摘要：目的發(fā)酵并純化重組人β-防御素2(HBD2)，為其生物活性的檢定奠定基礎(chǔ)。方法利用罐發(fā)酵人β-防御素2工程菌，并建立重組人β-防御素2的層析純化工藝。結(jié)果確定了工程菌優(yōu)化的最佳發(fā)酵條件為高溶氧、低溫誘導(dǎo)策略，獲得了高密度發(fā)酵工藝。建立了重組人β-防御素2的特殊純化工藝。結(jié)論完成了重組人β-防御素2的發(fā)酵和純化工藝研究。

關(guān)鍵詞：人β防御素2；工程菌；融合蛋白；發(fā)酵；蛋白純化

(ChinJLabDiagn,2016,20:0362)

人β防御素(HBD)是具有廣泛抑菌作用的多肽[1,2],本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了BL21(λDE3) TrX-B plysS/pET32a/ TrX-A-HBD2[3]并進(jìn)行了罐裝發(fā)酵培養(yǎng)[4]；建立了人β防御素2融合蛋白制備工藝,獲得的HBD2結(jié)構(gòu)與原蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)一致[5]。為人β防御素2重組蛋白實(shí)際應(yīng)用提供材料及佐證。

1材料與方法

1.1材料

原核細(xì)胞培養(yǎng)罐(上海保興)，重組人β防御素 2工程菌(本課題組制備)[1,3]，離心機(jī)(貝克曼庫(kù)爾特)，層析設(shè)備及介質(zhì)(通用公司)，培養(yǎng)基和誘導(dǎo)劑(奧克斯德)，分析純化學(xué)試劑(國(guó)產(chǎn))，腸激酶 (西格瑪)。

1.2方法

1.2.1菌種準(zhǔn)備將凍存的重組人β防御素 2工程菌復(fù)蘇，挑單菌，接種于5 ml液體培養(yǎng)基中，經(jīng)2次對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)接放大備用。

1.2.2罐培養(yǎng)原核細(xì)胞培養(yǎng)罐在位消毒后，調(diào)整pH值至7.2，罐溫37℃后接種，通過(guò)調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量維持溶氧在25%左右，發(fā)酵進(jìn)行到OD值≈10時(shí)，降低溫度至32℃，加入終濃度為1.2 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)， 6 h后終止發(fā)酵并低溫離心收集菌體。

1.2.3細(xì)菌裂解及鹽析細(xì)菌裂解采用加入少許硫酸鏈霉素的凍融方法，細(xì)菌充分裂解后離心去除固形物，上清加入固體硫酸銨進(jìn)行分步鹽析。

1.2.4人β防御素 2的粗純化20%-45%飽和硫酸銨分步沉淀的蛋白組分利用含0.5M NaCl 的Tris-Cl緩沖液重懸后，進(jìn)行Cu-IMAC階段層析純化，收集100-200 mM咪唑洗脫部分。

1.2.5人β防御素 2精純化利用50 mmol/L Tris-Cl，pH7.5緩沖液平衡G-25層析柱進(jìn)行樣品脫鹽，通過(guò)測(cè)定濃度和體積，計(jì)算蛋白質(zhì)總量，按照50∶1的比率加入腸激酶，于37℃作用3 h，酶切產(chǎn)物再經(jīng)過(guò)金屬螯合層析，收集流川峰，即獲得HBD2目的蛋白。

2結(jié)果

2.1工程菌經(jīng)過(guò)多次罐培養(yǎng)優(yōu)化后，獲得最優(yōu)罐培養(yǎng)參數(shù)：pH7.2，DO為28%，32℃低溫長(zhǎng)時(shí)間誘導(dǎo)，穩(wěn)定產(chǎn)率為20 g菌體/L左右。

2.2IMAC層析純化

通過(guò)階段式IMAC層析純化，電泳結(jié)果表明目的蛋白主要存在于100-200 mmol/L咪唑洗脫峰中，見圖1。

1:Fusion Protein M:Marker

2.3融合分子的酶切和分離

融合蛋白分子經(jīng)腸激酶作用后,由21 KD的完整分子被切割成16.5 KD和4.5 KD的兩個(gè)片段，再經(jīng)過(guò)一次IMAC，4.5 KD的目的片段在流川峰中被洗脫下來(lái)，電泳檢測(cè)純度達(dá)94%左右。

3討論

由于HBD2具有抑菌作用，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行HBD2的制備必須要遮蔽它的抑菌作用[3]，所以我們構(gòu)建了BL21(DE3)TrX-B plysS/pET32a/TrXA- HBD2重組工程菌[4,5]。外源基因的產(chǎn)量表達(dá)與每一個(gè)細(xì)胞濃度及其平均表達(dá)產(chǎn)量是成正比例的，為重組蛋白最高產(chǎn)量的獲得，依賴于與其相關(guān)的多種因素。pET32a作為本實(shí)驗(yàn)的表達(dá)載體，使用了T7啟動(dòng)子。T7啟動(dòng)子來(lái)自T7噬菌體,唯有被T7噬菌體基因1編碼的T7RNA聚合酶所識(shí)別，要使在T7啟動(dòng)子調(diào)控外源基因表達(dá)，必須具備可表達(dá)T7RNA聚合酶的宿主菌，T7RNA聚合酶是一種高活性的RNA聚合酶，其合成mRNA的速度比大腸桿菌RNA聚合酶快5倍左右[6]。要想獲得大量的表達(dá)目的蛋白的工程菌，發(fā)酵是一個(gè)重要途徑。由于發(fā)酵的很多因素都能影響工程菌的表達(dá)量，因此合適的發(fā)酵條件非常重要，本實(shí)驗(yàn)采用多種參數(shù)優(yōu)化，獲得了重組工程菌BL21( DE3)TrX-B plysS/pET32a/ TrXA- HBD2的最優(yōu)發(fā)酵條件并進(jìn)行了罐裝發(fā)酵培養(yǎng)。

由于可溶性表達(dá)作為本實(shí)驗(yàn)的目的蛋白表達(dá)方式，這樣就方便了純化，并同時(shí)省略了變性和復(fù)性的過(guò)程，由于添加了His Tag，融合蛋白質(zhì)分子能夠與金屬離子發(fā)生親和反應(yīng)，結(jié)合到金屬螯合層析介質(zhì)上，特異性吸附純化蛋白質(zhì)，更易純化目的蛋白，減少了損失，重組HBD2蛋白前添加了具有親和標(biāo)記的六個(gè)組氨酸，組氨酸具備的咪唑基團(tuán)既能將電子提供，與金屬離子結(jié)合，并且不易失活蛋白質(zhì)，在后續(xù)的分離純化過(guò)程中使重組HBD2蛋白仍然保持較高的活性。同時(shí)降低了成本，利用腸激酶酶切前后蛋白質(zhì)分子對(duì)金屬螯合層析介質(zhì)的吸附能力差異建立了簡(jiǎn)便易行的純化工藝，由于切入了腸激酶，簡(jiǎn)化了工藝提高了效果。

親和層析條件溫和，操作簡(jiǎn)單、快速，純化倍數(shù)高，甚至從復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中一步就可以將純化的蛋白質(zhì)分離出來(lái)[7]，且活性物質(zhì)回收率高，有利于含量低又不很穩(wěn)定的活性物質(zhì)的分離。因此，本實(shí)驗(yàn)中采用自建的純化工藝對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，獲得了純度達(dá)到94 以上的HBD2蛋白質(zhì)，為HBD2生物活性檢定奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

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[3]Hongtao Wei,Xuemei Han, Guoli Zhang,et al.Expression condition optimization and product structure analysis of human β-defensin-2 fusion protein in engineered bacteria[J].Advanced Materials Research,2013,782:1080.

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The study of the fermentation conditions and purification of recombinant HBD-2

ZHANGYan，SANGXue，WEIHong-tao，etal.

(China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

Abstract:ObjectiveOptimizing the fermentation conditions of engineering bacteria fusion protein of HBD-2 and purifying the obtained interest protein to lay a solid foundation for the assay of biological activity of HBD-2 recombinant protein.MethodsEngineering bacteria was ferment under the optimized condition,then collect engineering bacteria to purify and enzyme digest the target protein.ResultsOptimum fermentation condition of engineering bacteriahas been confirmed.The HBD2 fusion protein purification method has been established.ConclusionInterest protein has been obtained after fermentation and purification of HBD2 recombinant engineering bacteria,and recovery rate of interest protein has been enhanced.

Key words:HBD2；engineering bacteria; fusion protein; fermentation;protein purification

(收稿日期：2015-05-16)

作者簡(jiǎn)介：魏洪濤(1968-)，副主任醫(yī)師，副教授，碩士生導(dǎo)師，多年從事口腔抗微生物抗腫瘤研究。

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類號(hào)：TQ92

文章編號(hào)：1007-4287(2016)03-0362-02

*通訊作者