戴曉麗

(青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東 青島 266042)

山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(Q2006B02) 收稿日期：2013-08-20

作者簡介：戴曉麗(1989-)，女，山東即墨人，碩士研究生，研究方向：藥物化學(xué),E-mail:dxlqust@163.com。

doi

：10.3969/j.issn.1672-5425.2013.12.004

植物中特定果聚糖的合成研究進(jìn)展

戴曉麗

(青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東 青島 266042)

果聚糖，是由多種細(xì)菌和植物產(chǎn)生的一種果糖聚合物，是重要的存儲碳水化合物;菊苣是一種商業(yè)果聚糖生產(chǎn)作物。果聚糖在菊苣體內(nèi)的生物合成是難以控制的。特定果聚糖是原本非果聚糖積累植物引進(jìn)果糖基轉(zhuǎn)移酶基因的成功表達(dá)。較為系統(tǒng)地綜述了果聚糖的生物合成及修改、特定果聚糖的合成、果聚糖的功能及應(yīng)用等方面的研究進(jìn)展。

果聚糖；植物；菊苣；果糖基轉(zhuǎn)移酶；轉(zhuǎn)基因

果聚糖是由果糖單元和葡萄糖殘基末端組成的聚合物，廣泛存在于生物有機(jī)體(細(xì)菌、某些真菌和約15%的被子植物)中。按糖苷鍵的連接類型果聚糖可劃分為3類：通過β(2-6)鍵連接的聚糖型果聚糖，主要存在于細(xì)菌和單子葉植物中[1]；通過β(2-1)鍵連接的線性菊糖型果聚糖，存在于雙子葉植物中[2]；通過線性β(2-1)鍵連接的果糖基單元連接到蔗糖葡萄糖部分的C1和C6位而成的果聚糖新生混合系列，存在于百合科[3]中。

細(xì)菌利用果聚糖作為能量儲存分子[4]和細(xì)胞保護(hù)層。植物病原細(xì)菌利用果聚糖層來阻斷宿主-病原體識別和抑制衰竭的植物細(xì)胞釋放的抑菌化合物[5]?？谇恢械逆溓蚓霉厶菍幼鳛檎辰觿?。果聚糖在細(xì)菌中的生物合成是由單一酶果糖基轉(zhuǎn)移酶(Fructosyl-transferase,EC2.4.1.10)完成的。在植物中，果聚糖作為一類重要的碳水化合物和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，被存儲在莖、塊莖或根中，在提高植物的抗寒、抗旱乃至抗鹽性能等方面發(fā)揮著重要作用[6]。由于果聚糖生產(chǎn)植物的遺傳多樣性，植物果聚糖鏈長變化范圍約為10～200個果糖基單元。與細(xì)菌果聚糖生物合成的單一性相比，植物果聚糖的生物合成由3種不同酶參與：蔗糖:蔗糖-1-果糖基轉(zhuǎn)移酶(Sucrose:sucrose 1-fructosyltransferase,1-SST，EC 2.4.1.99)、果聚糖：果聚糖-1-果糖基轉(zhuǎn)移酶(Fructan:fructan 1-fructosyltransferase,1-FFT，EC2.4.1.100)和果聚糖外水解酶(Fructan exohydrolase,1-FEH，EC3.2.1.153)。1-SST主要催化兩分子的蔗糖生成等摩爾的1-蔗果三糖(1-Kestose)；1-FFT催化1-蔗果三糖的果糖單元和其它果聚糖分子轉(zhuǎn)化成1-蔗果三糖和較高聚合度(DP)果聚糖分子，當(dāng)使用最短的果聚糖1-蔗果三糖作為果聚糖供體時，1-FFT可以提高平均聚合度(mDP)；1-FEH通過水解果聚糖單元末端催化菊糖降解,形成果聚糖和低聚合度菊糖[7]。

1 菊苣中果聚糖的生物合成

菊苣是一種商業(yè)化生產(chǎn)菊糖的作物，菊糖被儲存在其主根中，其質(zhì)量的重要參數(shù)之一是聚合物的長度。菊苣在春季播種，并在同年秋天收獲主根并提取菊糖。收獲時，菊糖聚合物的平均長度為9～10，每公頃的平均產(chǎn)量為11 000 kg 碳水化合物。播種7周后伴隨著果聚糖合成酶1-SST和1-FFT的誘導(dǎo)活性，主根開始增厚。1-SST的活性迅速升高，3周后達(dá)到最高[8]。播種10周后活性開始下降，直到11月的生長季只剩下10%的活性。1-FFT的活性呈現(xiàn)不同的模式，開始時緩慢上升，于4周后達(dá)到穩(wěn)定[9]。首月由于果糖基轉(zhuǎn)移酶的活性主要形成短菊糖，播種9周后菊糖分子累積聚合度達(dá)到25。Druart等[8]發(fā)現(xiàn)，菊糖的mDP在9月初達(dá)到最大值(約為16)后開始降低。van den Ende等[9]認(rèn)為，mDP下降的原因是在1-SST存在時，1-FFT催化下傳入的蔗糖作為果糖單元的受主。在低溫季節(jié)(10月中旬)，由于FEH-I的果聚糖外水解酶活性，mDP進(jìn)一步下降[10]。當(dāng)溫度低于4 ℃時，可誘導(dǎo)FEH-Ⅱ增強(qiáng)菊糖的降解。1-FFT和1-FEH在秋季的降解催化對工業(yè)菊糖的生產(chǎn)是很不利的，尤其是對高聚合度菊糖的生產(chǎn)。從菊苣菊糖生物合成的研究可以得出結(jié)論：1-SST活性下降和1-FEH活性升高都會對mDP產(chǎn)生不利影響。為生產(chǎn)高聚合度、高產(chǎn)量的菊糖或改變果聚糖連接型，菊苣中果聚糖合成的修改得到了廣泛關(guān)注。

2 果聚糖生物合成的修改

2.1為得到較高mDP和產(chǎn)量，菊苣中果聚糖生物合成的修改

提高菊苣菊糖mDP的方法主要有兩種：(1)阻止在生長季節(jié)末期1-SST活性的降低。在生長季節(jié)內(nèi)源性酶1-SST活性下降，為此Koops等[11]從菊芋中分離出兩種不同的1-sst基因(sst-Ⅰ和sst-Ⅱ)在CAMV-35S啟動子控制下得到表達(dá)。為了研究引入基因的效果，含有一個額外的1-sst基因的植物在類似條件下培育生長。野生菊苣內(nèi)1-SST活性降低和通過1-FFT對蔗糖的果糖基轉(zhuǎn)移酶活性的作用通常發(fā)生在9～11月，對這段時期的菊糖mDP和1-SST、1-FFT、1-FEH的活性進(jìn)行了監(jiān)測。比較控制植物與含有菊芋sst-Ⅱ基因的植物發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因?qū)?-SST總活性有著顯著的貢獻(xiàn)。在實(shí)驗(yàn)第8周，這種額外的1-SST活性導(dǎo)致mDP上升20%。但是，含有sst-Ⅰ基因的植物并沒有呈現(xiàn)出較高水平的1-SST活性，也沒有表現(xiàn)出mDP的顯著改變。然而低溫下，這兩種類型的轉(zhuǎn)基因植物(含有sst-Ⅰ或sst-Ⅱ)和野生植物產(chǎn)生相似的mDP降低的影響，在生長季節(jié)結(jié)束時未生成較長鏈的果聚糖，最有可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)結(jié)束時低溫下FEH的誘導(dǎo)。(2)降低1-FEH活性以提高菊苣菊糖在收獲時的mDP。如將組成型CAMV-35S啟動子驅(qū)動的FEH-Ⅰ反義片段插入菊苣基因組中。但是在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因冷處理特別是誘導(dǎo)FEH-Ⅰ時，對mDP只有輕微的影響，可能的解釋是，剩下的feh-Ⅰ導(dǎo)致足夠的1-FEH活性來降低mDP。

2.2為改變果聚糖類型，菊苣中果聚糖生物合成的修改

Sprenger等將大麥中蔗糖:果聚糖-6-果糖基轉(zhuǎn)移酶(Sucrose:fructan 6-fructosyltransferase,6-SFT)引入到菊苣中，以生產(chǎn)混合型果聚糖，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物主根中的菊糖組合物并沒有改變。然而，放置在蔗糖溶液中的菊苣葉切片在光照下連續(xù)積累β(2-1)菊糖和β(2-6)果聚糖證明了菊苣中大麥6-SFT的功能性；延長光照后，轉(zhuǎn)基因葉片中的大多數(shù)果聚糖是菊糖型，只有一小部分含有混合型果聚糖。原因可能是1-FFT對底物的競爭勝過異源6-SFT。這種對底物的競爭也可能是主根中混合型果聚糖存在的原因，并可能由于6-sft比內(nèi)源性1-fft有較低的表達(dá)或是1-FFT對底物有較高的親和力。另外，Vijn等[12]將洋蔥編碼基因6G-FFT引入到菊苣中?？傊瑸榱颂岣適DP或改變果聚糖類型，修改菊苣中菊糖代謝的嘗試方法包括額外基因的轉(zhuǎn)入和外水解酶基因的抑制。雖然轉(zhuǎn)入基因具有功能性并且在轉(zhuǎn)基因植物中可檢測到基因抑制，但在mDP和菊糖組成上只有很少的預(yù)期效果。強(qiáng)啟動子可以用于驅(qū)動外源基因的表達(dá)，例如菊苣中的1-fft啟動子；為了阻止外水解酶的活性，3個feh基因(feh-Ⅰa、feh-b、feh-Ⅱ)可能需要被抑制，最好使用更有效的基因沉默技術(shù)，如RNA干擾(RNAi)、敲除突變體等。

2.3 其它植物中果聚糖生物合成的修改

枯草芽孢桿菌的sacB基因在黑麥草中表達(dá)的研究表明，果聚糖在植物中的積累干擾了果聚糖的天然結(jié)構(gòu)。天然的高聚合度果聚糖被耗盡，而較低聚合度果聚糖的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變[13]。將從大麥中提取到的6-gff或1-sst在黑麥草中表達(dá)，得到了比野生型植株中多15%的果聚糖，表明在不損害植物生長的情況下增加了果聚糖含量[14]。Sobobel等[15]發(fā)現(xiàn)大腸桿菌天冬酰胺合成酶在轉(zhuǎn)基因萵苣中過度表達(dá)累積的果聚糖是野生植物累積的30倍。

上述研究顯示，天然果聚糖的組成可以在轉(zhuǎn)基因植物中被顯著改變，對果聚糖產(chǎn)量和組成的影響比早期的轉(zhuǎn)基因菊苣更為明顯。

3 特定果聚糖的合成

特定果聚糖，即具有所需鏈長度和連接型的果聚糖，主要依賴于適當(dāng)基因的選擇。Koops等[11]采用轉(zhuǎn)基因甜菜作為特定果聚糖的事例證明1-sst基因和1-fft基因的不同組合產(chǎn)生具有不同菊糖類型的甜菜轉(zhuǎn)化體。將洋蔥的1-sst和6-gff成功轉(zhuǎn)入甜菜中也可獲得特定分支的果聚糖[16]。除了用于生物合成的基因源，可用的底物和與其它碳水化合物的生物合成途徑的競爭對果聚糖的積累也是很重要的。

3.1 蔗糖的可用性決定了果聚糖產(chǎn)量

宿主作物是非常重要的產(chǎn)率影響因素。馬鈴薯與甜菜相比都具有相同的菊芋1-sst基因，但產(chǎn)量差距很大，相比馬鈴薯，甜菜積累了50倍以上的菊糖[17，18]。同樣，相比淀粉積累品種，淀粉缺乏的玉米可以累積60倍的菊糖而得到更高產(chǎn)率?；谔鸩撕偷矸廴狈τ衩锥伎梢苑e累較高產(chǎn)率的蔗糖，可以得出結(jié)論，蔗糖可用性是這些轉(zhuǎn)基因植物中果聚糖產(chǎn)量的決定性因素。

3.2 果聚糖積累與淀粉的競爭

許多果聚糖積累的平臺植物也可生產(chǎn)淀粉，碳水化合物的合成途徑與果聚糖的生物合成使用相同的底物，可能具有競爭性。對存儲蔗糖的轉(zhuǎn)基因淀粉缺乏玉米的果聚糖積累量和轉(zhuǎn)基因淀粉積累玉米的果聚糖積累量進(jìn)行比較時，相同的果糖基轉(zhuǎn)移酶基因得以表達(dá)，轉(zhuǎn)基因淀粉缺乏玉米積累的果聚糖為20 mg·gFW-1，轉(zhuǎn)基因淀粉積累玉米產(chǎn)量較前者少60倍[17]。在馬鈴薯作為宿主生產(chǎn)果聚糖的研究中，Caimi等[19]報(bào)道了減少淀粉量的情況，說明了種子質(zhì)量的大幅減少和淀粉含量的減少，主要是由于蔗糖合成酶和蔗糖SacB蛋白質(zhì)之間的競爭。從這些研究中可以得出結(jié)論,淀粉積累作物生產(chǎn)果聚糖時，淀粉生產(chǎn)和果聚糖的生物合成對蔗糖的競爭，會影響兩者或其中之一的存儲碳水化合物的合成，也不利于在平臺作物上生產(chǎn)果聚糖。

3.3 生產(chǎn)特定果聚糖的平臺作物

優(yōu)良的適合果聚糖生產(chǎn)的平臺作物是高產(chǎn)率、擁有大存儲器官積累蔗糖并只有很少或根本沒有淀粉產(chǎn)生的植物，并且具有可用的原料提取處理鏈。甜菜能夠積累高濃度的蔗糖(200 mg·gKW-1)，產(chǎn)率為10～14 t·hm-2，生產(chǎn)提取過程可參照菊苣菊糖，是一種成功的果聚糖生產(chǎn)平臺作物[11,16,18]。另一種潛在的強(qiáng)大平臺作物是甘蔗，具有較高的蔗糖含量(成熟莖節(jié)500 mg·gDW-1[20])和完善的畜牧業(yè)加工鏈，產(chǎn)率(6～14 t·hm-2)與甜菜相近。Nicholson[21]成功地在甘蔗中引進(jìn)了朝鮮薊的1-SST，可在相似條件下生產(chǎn)1-蔗果三糖，但產(chǎn)量(112 nmol·gFW-1)較轉(zhuǎn)基因甜菜低1000倍。水稻也被證明能夠表達(dá)1-sst和6-sft基因，表達(dá)1-sst的轉(zhuǎn)基因水稻在葉片中能累積達(dá)16 mg·gFW-1的果聚糖[22]。雖然相比之下轉(zhuǎn)基因水稻的果聚糖濃度較低，但是可以在原本無用的水稻葉中生產(chǎn)果聚糖，提高了利用價值。綜上所述，果聚糖生產(chǎn)最具潛力的平臺作物是甜菜和甘蔗，其次是水稻。

4 結(jié)語

多種細(xì)菌和植物果糖基轉(zhuǎn)移酶基因已被轉(zhuǎn)入許多不同的植物中，如單子葉植物(水稻、玉米、甘蔗等)、雙子葉植物(馬鈴薯、甜菜等)。果聚糖合成的修改或基因轉(zhuǎn)入效果主要參照果聚糖的產(chǎn)率、聚合物的長度和果聚糖連接型的改變。新平臺作物相比菊苣的生產(chǎn)水平(11 t菊糖·hm-2)可能還不具備競爭性，然而它們具有一定的優(yōu)點(diǎn)，為特定果聚糖的生產(chǎn)提供了良好的起點(diǎn)。甜菜、甘蔗和水稻是最具潛力的生產(chǎn)平臺作物。迄今為止，多種基因已從不同物種中分離用于生產(chǎn)特定果聚糖?？傊谄脚_作物中合成特定果聚糖的許多可能性是存在的，而且有些已被證實(shí)。

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RecentAdvancesofTailor-MadeFructanSynthesisinPlants

DAI Xiao-li

(CollegeofChemicalEngineering,QingdaoUniversityofScienceandTechnology,Qingdao266042,China)

Fructan,a fructose polymer,is produced by many bacteria and plants and used as carbohydrate reserve.Chicory is a commercial fructan producing crop.Studies using genetically modification showed that fructan biosynthesis is difficult to steer in chicory.Alternatives for production of tailor-made fructan,fructan with a desired polymer length and linkage type,are originally nonfructanaccumulating plants expressing introduced fructosyltransferase genes.Fructan biosynthesis and its modification,synthesis of tailor-made fructan,and function and utilization of fructan were briefly reviewed in the article.

fructan;plant;chicory;fructosyltransferase;genetic modification

Q 943.2

A

1672-5425(2013)12-0014-04