秦 玥 ，劉夢培 ，傅大立 ,2，朱高浦 ，趙 罕

（1.中國林業(yè)科學研究院 經(jīng)濟林研究開發(fā)中心，河南 鄭州 450003；2.北京林業(yè)大學，北京 100083）

華仁杏Armeniaca cathayanaD. L. Fuet al.屬于薔薇科Rosaceae李亞科Subfam. Prunoideae杏屬ArmeniacaScop.，是2010年傅大立等發(fā)表的我國杏屬一新種[1]。華仁杏是我國重要的木本糧食與油料兼用樹種，具有果核薄、杏仁大、無苦味、含油率高、油質(zhì)上乘、抗性強等優(yōu)良特性。華仁杏種質(zhì)資源豐富，栽培品種較多，但其相關的分子標記研究鮮見報道，新種發(fā)表至今，僅有極少數(shù)學者就其不同品種與雜交種進行了分子標記研究[2-5]。

研究華仁杏的SSR引物，對尋求科學準確的種質(zhì)鑒定技術，解決其生產(chǎn)中存在的品種混雜、同名異物現(xiàn)象具有重要意義。SSR分子標記是近幾年發(fā)展起來的利用范圍較廣的分子標記技術，具有多態(tài)性高、重復性好、共顯性遺傳、數(shù)量豐富、對基因組覆蓋性高等優(yōu)勢[6-8]。目前，SSR分子標記技術以其獨特的優(yōu)勢在遺傳多樣性分析[9-10]、遺傳連鎖圖譜構建[11-12]、基因定位[13]等研究中均發(fā)揮了重要作用。由于華仁杏為近年發(fā)現(xiàn)的新種，目前適用于華仁杏研究的SSR引物未見報道，無法滿足其品種鑒別和起源演化等研究的需要，因此，加快開發(fā)華仁杏SSR引物篩選工作顯得尤為重要。關于其它物種的研究表明[14-16]，SSR分子標記在屬內(nèi)不同種間具有一定的通用性，甚至在不同屬間也具有一定的通用性。因此對近緣物種已開發(fā)的SSR引物進行篩選，也是一條獲取SSR引物的重要途徑。

本研究中利用SSR分子標記技術，以華仁杏為供試材料，篩選適合的多態(tài)性引物，旨在為華仁杏遺傳資源的進一步評價研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試華仁杏材料均采集于中國林業(yè)科學研究院張家口實驗基地，共60份（見表1）。SSR引物均由上海英俊公司合成，試驗中所用試劑均購于Takara公司。

表1 供試的華仁杏品種Table 1 The tested cultivars of Armeniaca cathayana

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取

取60份華仁杏幼嫩健康的葉片，利用試劑盒法提取基因組DNA，并用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測其質(zhì)量和濃度。

1.2.2 PCR擴增

PCR反應體系總體積20 μL，其中Premix Taq Version 2.0（Loading dye mix） 9 μL，上下游引物各1 μL（10 μmoL/L）、DNA模板1.5 μL（20 mg/L），ddH2O 7.5 μL。循環(huán)體系 94 ℃預變性 4 min，94 ℃變性40 s，53 ℃退火40 s，72 ℃延伸80 s，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.2.3 擴增產(chǎn)物檢測

擴增產(chǎn)物在110 V電壓下，利用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳，40 min后取出在全自動紫外與可見分析裝置中拍照。

具有清晰條帶的產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺凝膠（PAG）上電泳，200 V電壓，電泳2 h后，將膠取出放入之前配置好的染色液中染色。染色液的配制方法：10 mL 1 moL/L 的NaCl溶液中加入10 μL的10 000×Gelred原液，再用1×TBE定容到100 mL）。30 min后取出拍照[17]。

1.2.4 數(shù)據(jù)采集與統(tǒng)計分析

將電泳圖譜上同一位置清晰出現(xiàn)的條帶記為1，沒有條帶記為0，記錄過程中，統(tǒng)計主要帶型，忽略弱雜帶型，構建SSR引物擴增結果的數(shù)據(jù)庫。統(tǒng)計每對SSR引物PCR擴增出的不同等位位點數(shù)，計算每個SSR位點的多態(tài)性信息含量指數(shù)（PIC），，其中Pi為某個SSR位點的第i個等位變異出現(xiàn)頻率占該位點全部等位變異出現(xiàn)頻率的比率。并用PopGene軟件計算雜合度、Shannon指數(shù)等信息。

2 結果與分析

2.1 SSR引物篩選結果

利用8份華仁杏樣品進行65對李亞科SSR引物的篩選，其中31對引物多態(tài)性較高、穩(wěn)定性較好并且分辨率較高。利用這31對SSR引物對60份華仁杏材料進行擴增，得到產(chǎn)物片段大小在67～394 bp之間，部分電泳結果如圖1與圖2所示，篩選出的31對引物的信息見表2。

2.2 引物SSR位點分析

利用篩選出的31對SSR引物在60個華仁杏樣品中檢測到138個等位基因位點，每對引物可檢測2～7個等位位點，平均等位位點數(shù)為4.5個。其中，以引物aprigms20、aprigms24和BPPCT030檢測的等位基因最多。平均多態(tài)性信息含量指數(shù)（PIC）為0.72，變化范圍為0.28～0.90，以引物aprigms18的值最高，引物Pchgms2的值最低。

利用PopGene軟件分析31對引物對60份華仁杏材料的檢測結果，結果見表3。從表3可以看出：平均觀測雜合度為0.533 6；引物BPPCT002的值最高，為0.867 9；引物Pchgms2的最低，為0.050 0。平均期望雜合度為0.580 8；引物BPPCT030的值最高，為0.785 9；引物Pchgms2的最低，為0.065 4。Nei指數(shù)（h）的分布范圍在0.064 9～0.779 1之間，平均每個位點的h值為0.575 4。平均每個位點的Shannon信息指數(shù)（I）值為0.646 5；引物BPPCT030的I值最高，為1.674 6；引物Pchgms2的值最低，為0.164 9。

圖1 引物BPPCT030的部分擴增產(chǎn)物的6%聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig.1 6% PAGE gel electrophoresis of part of ampli fied products with primer BPPCT030

圖2 引物Pchgms2的部分擴增產(chǎn)物的6%聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig.2 6% PAGE gel electrophoresis of part of ampli fied products with primer Pchgms2

表2 篩選出的31對SSR引物對60份供試材料的擴增結果Table 2 Amplification result of 60 samples by using 31 pairs of primers

表3 華仁杏引物的SSR擴增統(tǒng)計結果和基因多樣性分析Table 3 SSR amplification results of primers and analysis of genetic diversity in Armeniaca cathayana

3 討論與結論

本研究以華仁杏不同品種作為試驗材料，從65對已公開發(fā)表的SSR引物中篩選出31對引物，可以擴增出清晰的條帶。該31對引物中既包括杏屬引物，也包括李屬及少量其它薔薇科引物，由此可見，SSR標記具有較好的通用性。

利用31對引物在60份華仁杏材料中進行PCR擴增，共檢測到138個等位基因位點，每對引物可檢測2～7個等位位點，其中有3對引物等位位點數(shù)達到7。較高的多態(tài)性顯示了SSR標記具有較高的應用價值，同時也反映了供試材料在該位點存在較大的遺傳差異[18]。

PIC值、雜合度、Nei’s基因多樣性、Shannon信息指數(shù)均是描述引物多態(tài)性的指標。計算每對引物的PIC值，最高可達0.9，平均值也高達0.72，較玉米[19]、辣椒[20]、甜瓜[21]等其它多數(shù)物種偏高。一般認為當PIC＞0.5時，該引物為高度多態(tài)性信息引物；當0.25＜PIC＜0.5時，為中度多態(tài)性信息引物；當PIC＜0.25時，為低度多態(tài)性信息引物[22]。本研究中所得平均期望雜合度及觀測雜合度分別為0.533 6及0.580 8，較Fatemeh等[23]和張淑青等[24]試驗所得值0.628和0.68偏低。

綜合幾個指標，31對引物中鑒別能力最強的2對引物為BPPCT030和aprigms18，最弱的2對引物為Pchgms2和aprigms23。

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