王 娟，敖 紅，張會慧，田 野，孫廣玉

(東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150040)

鹽脅迫是限制植物生長發(fā)育的主要環(huán)境因素之一，較高的土壤含鹽量不但限制植物的生長發(fā)育[1]，而且植物吸收過量的鹽離子會使其體內(nèi)離子平衡紊亂[2]、活性氧爆發(fā)[3]、細(xì)胞膜系統(tǒng)被傷害、光合機(jī)構(gòu)被損傷及光合能力降低。植物光合作用中的PSⅡ反應(yīng)中心的活性被認(rèn)為是鹽脅迫下比較脆弱的環(huán)節(jié)之一[4]，當(dāng)環(huán)境條件發(fā)生變化時，植物體內(nèi)葉綠素?zé)晒獾淖兓稍谝欢ǔ潭壬戏从吵霏h(huán)境因子對植物的影響[5-7]，根據(jù)快相葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)曲線（OJIP）可以推測出PSⅡ復(fù)合體的生理狀態(tài)，分析逆境脅迫對植物光合作用的作用位點(diǎn)，這已成為研究植物抗逆性的重要手段之一[8]。

黑龍江省的部分城鎮(zhèn)位于松嫩平原的鹽堿地區(qū)，同時該省所有城鎮(zhèn)均使用含鹽的融雪劑融化冬季道路上的積雪，因此，選育耐鹽的綠化植物是黑龍江省城鎮(zhèn)綠化工作中首要考慮的問題之一。目前，有關(guān)綠化樹種在鹽脅迫條件下其光合及生理特性的研究報道較多[9-11]，這些研究涉及到植物的生長特點(diǎn)、滲透調(diào)節(jié)和抗氧化酶等方面，但有關(guān)鹽脅迫下黑龍江省綠化灌木樹種葉片光系統(tǒng)Ⅱ響應(yīng)特性及利用PSⅡ參數(shù)進(jìn)行耐鹽性評價方面的研究卻鮮見報道。為此，以紫丁香、白丁香、暴馬丁香、連翹、茶條槭和金銀忍冬等6種黑龍江省常見的綠化灌木樹種為材料，利用快相葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)，研究了6種灌木葉片PSⅡ在不同濃度NaCl脅迫下的快速反應(yīng)情況，并比較分析了NaCl脅迫下6種灌木葉片PSⅡ功能的耐鹽性，以期為篩選耐鹽性的綠化樹種提供一些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為鹽堿地區(qū)的城市綠化和植被恢復(fù)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

試驗(yàn)于2012年6月在哈爾濱市東北林業(yè)大學(xué)植物生理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，供試材料為紫丁香Syringa oblata、白丁香Syringa oblatavar.alba、暴馬丁香Syringa reticularvar.mandshurica、連翹Forsythia suspense(Thunb.) Vahl、茶條槭Acer ginnala和金銀忍冬Lonicera maackii(Rupr.) Maxim.，均為東北林業(yè)大學(xué)校園的多年生綠化植物，且其生境周圍并無高大樹木遮陰，用剪刀剪取位于樹冠南向外圍、長勢相對一致且無病蟲害的一年生枝條，迅速插入裝有蒸餾水的廣口瓶中立即帶回實(shí)驗(yàn)室。

將6種灌木樹種的枝條剪成 40 cm左右長，每個枝條保留4片完全展開葉，將枝條下端分別放入含有不同濃度NaCl溶液的三角瓶中（但葉片不能浸入溶液中）進(jìn)行鹽脅迫處理，在溶液中將各個品種枝條再剪掉一小段，以防形成的氣泡阻礙水分向上運(yùn)輸，NaCl溶液濃度分別設(shè)為50、100、150和200 mmol·L-1，pH值保持在7.0左右，以蒸餾水為對照，每個處理3次重復(fù)，將處理好的試材放入設(shè)定溫度為25（光照）或23（黑暗）℃、光照強(qiáng)度為400 μmol·m-2s-1、光周期為12（光照）或12（黑暗）h、相對濕度為75%的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后測定其葉綠素?zé)晒鈪?shù)值。

1.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定方法

利用Mini調(diào)制式掌上葉綠素?zé)晒鈨x(FluorPen FP 100 max，捷克)測定經(jīng)0.5 h暗適應(yīng)后每個處理的各個樹種變化趨勢均勻的完全展開葉片的OJIP曲線，得到其葉綠素?zé)晒鈪?shù)：PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)、PSⅡ的潛在光化學(xué)活性(Fv/Fo)、OJIP曲線上2 ms時的相對可變熒光強(qiáng)度(VJ)、熒光上升的初始斜率(Mo)、活性反應(yīng)中心的開放程度(Ψo)、原初光化學(xué)反應(yīng)的最大量子產(chǎn)額(φPo)、非光化學(xué)猝滅的最大量子產(chǎn)額(φDo)、吸收光能用于QA－以后的電子傳遞的能量比例(φEo)、單位反應(yīng)中心吸收的光能(ABS/RC)、單位反應(yīng)中心捕獲的用于還原QA的能量(TRo/RC)、單位反應(yīng)中心捕獲的用于電子傳遞的能量(ETo/RC)和單位反應(yīng)中心耗散掉的能量(DIo/RC)等參數(shù)。葉片的測定部位選擇從葉基部數(shù)起的第3與第4葉脈之間，距離主葉脈2 cm左右處，每個處理的測定重復(fù)5次。

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計方法

采用 Microsoft Excel軟件對測定數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和統(tǒng)計分析，文中各圖中的數(shù)值均為（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）(mean±SD)。采用隸屬函數(shù)法綜合評判了6個灌木樹種PSⅡ功能的耐鹽性，采用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)值的方法計算其隸屬函數(shù)值X(ij)，當(dāng)某一參數(shù)與植物的耐鹽性呈正相關(guān)時，即采用如下公式計算：

而當(dāng)某一參數(shù)與植物耐鹽性呈負(fù)相關(guān)時，則采用如下反隸屬函數(shù)值的公式計算：

上述兩式中：X(ij)表示i種類j指標(biāo)的隸屬值；Xij表示i種類j指標(biāo)的測定值；Xjmax、Xjmin分別為指標(biāo)的最大值和最小值[12]。然后求其各隸屬函數(shù)的總和，再據(jù)此值對6個灌木樹種的耐鹽性進(jìn)行排序，總值越大，則表示該植物的耐鹽性越強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對葉片PSⅡ反應(yīng)中心最大光化學(xué)效率和潛在光化學(xué)活性的影響

NaCl脅迫下6個灌木樹種葉片PSⅡ反應(yīng)中心的最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)和潛在光化學(xué)活性(Fv/Fo)的變化曲線如圖1所示。圖1顯示，6種綠化灌木葉片的Fv/Fm和Fv/Fo值隨著鹽濃度的增加均呈降低趨勢，但是，在不同鹽濃度下不同樹種的變化趨勢不同。當(dāng)NaCl濃度低于50 mmol·L-1時，6個灌木樹種葉片的Fv/Fm值均無明顯變化；當(dāng)鹽濃度在50～150 mmol·L-1時，暴馬丁香、連翹和紫丁香葉片的Fv/Fm值均明顯下降，金銀忍冬和茶條槭均無明顯變化；而當(dāng)鹽濃度大于150 mmol·L-1時，白丁香葉片的Fv/Fm值才呈下降趨勢。隨著鹽濃度的升高，茶條槭和金銀忍冬的Fv/Fo值的變化幅度較小，同F(xiàn)v/Fm值的變化情況相似，白丁香葉片的Fv/Fo值也僅在鹽離子濃度大于150 mmol·L-1時才明顯下降，但連翹、紫丁香和暴馬丁香葉片的Fv/Fo值隨著鹽離子濃度的增加其降低趨勢均較明顯。

圖1 NaCl脅迫對6個灌木樹種葉片PSⅡ反應(yīng)中心最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)和潛在光化學(xué)活性(Fv/Fo)的影響Fig.1 Effects of NaCl stress on maximum photochemical efficiency (Fv/Fm) and potential photochemical activities (Fv/Fo)of PSⅡ in leaves of six kinds of shrubs

2.2 鹽脅迫對6個灌木樹種葉片光合電子傳遞鏈上QA-氧化還原狀態(tài)的影響

NaCl脅迫對6個灌木樹種葉片QA-氧化還原狀態(tài)的影響情況如圖2所示。從圖2中可以看出，當(dāng)鹽濃度在0～50 mmol·L-1時，6個灌木樹種葉片的VJ和Mo值均無明顯的變化，而當(dāng)鹽濃度大于50 mmol·L-1時，不同樹種葉片的VJ和Mo值的變化趨勢明顯不同，但隨鹽濃度的增加均呈增加趨勢。當(dāng)鹽濃度大于100 mmol·L-1時，隨著鹽濃度的增加，連翹、紫丁香和暴馬丁香的VJ和Mo值均呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢，而金銀忍冬的VJ和Mo值均無明顯的變化，茶條槭的VJ值無明顯變化，而其Mo值卻緩慢上升。白丁香的VJ和Mo值在鹽濃度小于150 mmol·L-1時與金銀忍冬和茶條槭的相似，沒有發(fā)生明顯的變化，而在鹽濃度大于150 mmol·L-1時卻顯著上升。

圖2 NaCl脅迫對6個灌木樹種葉片QA- 氧化還原狀態(tài)的影響Fig.2 Effect of NaCl stress on QA- redox state in leaves of six kinds of shrubs

2.3 鹽脅迫對6個灌木品種葉片PSⅡ反應(yīng)中心吸收光能分配參數(shù)的影響

NaCl脅迫對6個灌木樹種葉片PSⅡ反應(yīng)中心吸收光能量分配參數(shù)的影響情況如圖3所示。由圖3可知，隨著鹽濃度的增加，6個灌木樹種葉片的OJIP曲線上2 ms時有活性反應(yīng)中心的開放程度(Ψo)降低，葉片的原初光化學(xué)反應(yīng)的最大量子產(chǎn)額(φPo)和用于電子傳遞的量子產(chǎn)額(φEo)均降低，而用于熱耗散的比例(φDo)卻增加。當(dāng)鹽濃度在0～50 mmol·L-1時，6個灌木樹種葉片的Ψo、φPo、φEo和φDo值均沒有發(fā)生明顯的變化；當(dāng)鹽濃度大于50 mmol·L-1時，連翹、紫丁香和暴馬丁香這3種樹種葉片的Ψo、φPo和φEo值均隨著鹽濃度的增加而明顯降低，而金銀忍冬和茶條槭的Ψo、φPo和φEo各參數(shù)的變化趨勢均不明顯，白丁香葉片的以上各參數(shù)在鹽濃度超過150 mmol·L-1時才會發(fā)生明顯的變化。

圖3 NaCl脅迫對6個灌木樹種葉片PSⅡ反應(yīng)中心吸收光能分配參數(shù)的影響Fig.3 Effect of NaCl stress on the distribution parameters of PSⅡ light energy absorption in leaves of six kinds of shrubs

2.4 鹽脅迫對6個灌木品種葉片單位PSⅡ反應(yīng)中心比活參數(shù)的影響

NaCl脅迫對6個灌木樹種葉片ABS/RC、TRo/RC、ETo/RC和DIo/RC值的影響情況如圖4所示。由圖4可知，當(dāng)鹽濃度在0～50 mmol·L-1時，6個灌木樹種葉片PSⅡ反應(yīng)中心的比活參數(shù)無明顯變化；當(dāng)鹽濃度大于50 mmol·L-1時，天線色素吸收的能量ABS/RC和用于熱耗散的能量DIo/RC均呈上升趨勢，其中茶條槭和金銀忍冬變化不明顯；連翹葉片單位反應(yīng)中心捕獲的用于還原QA的能量TRo/RC在鹽濃度逐漸升高時卻呈下降趨勢，而其他品種均無明顯的變化趨勢；當(dāng)鹽濃度大于50 mmol·L-1時，隨著鹽濃度的增加，6個樹種葉片吸收光能用于電子傳遞的能量ETo/RC均明顯減少，其中金銀忍冬和茶條槭的變化趨勢均不明顯，而連翹和紫丁香的降低幅度均較大。

2.5 鹽脅迫對6個灌木品種光系統(tǒng)Ⅱ耐鹽性的綜合評價

植物的耐鹽性是一種復(fù)雜的生理反應(yīng)，利用單一指標(biāo)鑒定植物耐鹽性的局限性很大。因此，在對植物耐鹽性的研究中，往往采用多指標(biāo)進(jìn)行綜合評判。本試驗(yàn)為了較全面地評價6個灌木樹種PSⅡ功能的耐鹽性，采用模糊數(shù)學(xué)中的隸屬函數(shù)法，根據(jù)隸屬函數(shù)總值的大小對6個灌木品種葉片PSⅡ反應(yīng)中心能力進(jìn)行排序，得到6個灌木樹種PSⅡ功能的耐鹽性由強(qiáng)到弱的順序?yàn)椋航疸y忍冬＞茶條槭＞白丁香＞暴馬丁香＞連翹＞紫丁香。

3 討 論

鹽脅迫主要包括離子毒害和離子吸收不平衡即營養(yǎng)虧缺[13]，許多研究結(jié)果已經(jīng)表明，鹽脅迫使植物的生長受到抑制，能耗增加，衰老加速，生長量降低[14]，鹽脅迫抑制植物光合碳同化過程而產(chǎn)生過剩激發(fā)能，進(jìn)而能夠直接或間接地影響植物PSⅡ的功能[15]。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在低濃度的鹽(Na+濃度為0～50 mmol·L-1)脅迫下，6個灌木品種的各個葉綠素?zé)晒鈪?shù)均無明顯變化。當(dāng)鹽濃度大于50 mmol·L-1時，各品種灌木的最大光化學(xué)效率Fv/Fm和潛在光化學(xué)活性Fv/Fo均有不同程度的降低，但不同樹種的變化程度不同，金銀忍冬和茶條槭的降低幅度最小，說明這兩種樹的PSⅡ?qū)}脅迫的抵抗能力最強(qiáng)，而連翹、紫丁香和暴馬丁香PSⅡ的耐鹽性均較差，白丁香在低于150 mmol·L-1的鹽脅迫下可以保持較高的PSⅡ反應(yīng)中心活性，而當(dāng)鹽濃度大于150 mmol·L-1時其PSⅡ反應(yīng)中心的活性才會明顯降低。鹽脅迫會使光合電子傳遞鏈上的電子傳遞受阻，特別是電子從QA-到QB過程是最為敏感的環(huán)節(jié)之一[16]，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，鹽濃度逐漸升高時，6個樹種葉片2 ms時的相對可變熒光強(qiáng)度VJ和QA被還原的最大速率Mo值均呈明顯增加的趨勢，表明了QA-明顯積累，由此推測，鹽脅迫可能抑制了電子從QA-到QB的傳遞，會使單位反應(yīng)中心捕獲的用于電子傳遞的能量下降，從而使2 ms時有活性的反應(yīng)中心的開放程度降低，說明鹽脅迫抑制了PSⅡ受體側(cè)QA向QB的電子傳遞，

其原因可能是鹽脅迫導(dǎo)致QB位點(diǎn)改變從而降低了其與質(zhì)體醌結(jié)合的親和力。當(dāng)鹽溶液濃度大于100 mmol·L-1時，隨著鹽濃度的增加，連翹、紫丁香和暴馬丁香的VJ和Mo值均呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢，而金銀忍冬的VJ和Mo值均無明顯變化，說明鹽脅迫對金銀忍冬PSⅡ電子受體側(cè)的電子傳遞的影響較小，而對連翹、紫丁香和暴馬丁香的傷害較大，白丁香在鹽濃度大于150 mmol·L-1時其PSⅡ電子受體側(cè)的電子傳遞才會受到明顯的抑制。

圖4 NaCl脅迫對6個灌木樹種葉片ABS/RC、TRo/RC、ETo/RC和DIo/RC值的影響Fig.4 Effect of NaCl stress on ABS/RC,TRo/RC,ETo/RC and DIo/RC in leaves of six kinds of shrubs

表1 NaCl脅迫下6個灌木品種的光系統(tǒng)Ⅱ耐鹽性各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值Table 1 Membership function values of salt tolerance of photosystem Ⅱ in leaves of six kinds of shrubs under NaCl stress

正常條件下有活性的 PSⅡ反應(yīng)中心能將捕獲的光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能用于碳代謝中光化學(xué)反應(yīng)途徑，而將剩余的激發(fā)能耗散掉[17]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，鹽濃度逐漸升高時，6個樹種葉片的φPo值均降低，而其φDo和DIo/RC值均增加，其φEo和ETo/RC值均減少，說明鹽脅迫明顯改變了6個樹種PSⅡ反應(yīng)中心吸收光能的分配情況，在較高濃度的鹽脅迫下，連翹、紫丁香和暴馬丁香3個樹種葉片的φPo、φEo和ETo/RC值隨著鹽濃度的增加而降低的趨勢均明顯大于金銀忍冬和茶條槭，而其φDo和DIo/RC值均呈相反的變化趨勢，說明在較高濃度的鹽脅迫下，金銀忍冬和茶條槭可以保證PSⅡ反應(yīng)中心吸收的光能優(yōu)先分配到光合電子傳遞鏈中，以保證同化力(ATP和NADPH)的積累。隨著鹽濃度的增加，6個樹種葉片有活性的反應(yīng)中心的開放程度Ψo下降，有關(guān)研究者發(fā)現(xiàn)，逆境下PSⅡ反應(yīng)中心會發(fā)生可逆失活，并且這些失活的反應(yīng)中心只是作為一個能量陷阱，只吸收光能但不能將吸收的光能傳遞到電子傳遞鏈中，以防止過剩光能產(chǎn)生激發(fā)而誘導(dǎo)活性氧的爆發(fā)[18]。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，單位反應(yīng)中心吸收的光能ABS/RC明顯增加，這可能是由PSⅡ反應(yīng)中心的活性和數(shù)量降低而造成的，從而增加了剩余反應(yīng)中心的活性。

用單一指標(biāo)評價植物的耐鹽性往往具有片面性，植物抗鹽機(jī)制是錯綜復(fù)雜的，是受植物多因素控制的[19]。在復(fù)合鹽脅迫下植物耐鹽性的綜合評定中，不能僅僅對單一指標(biāo)進(jìn)行分析，還需將各種指標(biāo)值進(jìn)行綜合分析，從而建立合適的數(shù)量化指標(biāo)體系來進(jìn)行抗鹽堿脅迫的綜合評價。本研究中采用了Fuzzy數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)綜合評判法，以12個葉綠素?zé)晒鈪?shù)為參考指標(biāo)，對6種灌木光系統(tǒng)Ⅱ的耐鹽性進(jìn)行了綜合評判，得出的6個灌木品種耐鹽性的高低順序?yàn)椋航疸y忍冬＞茶條槭＞白丁香＞暴馬丁香＞連翹＞紫丁香。因此，在我國北方鹽濃度較高的鹽漬化地區(qū)進(jìn)行城市綠化和植被恢復(fù)的過程中可以首先考慮金銀忍冬和茶條槭；而在鹽濃度低于150 mmol·L-1的鹽漬化地區(qū)，白丁香的光合特性反映了其具有很強(qiáng)的抗鹽能力，但連翹和紫丁香葉片的光合特性表現(xiàn)出其對鹽脅迫極為敏感，故在鹽漬化程度較高的地區(qū)種植時要慎重選用。

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