孫幫燕，張海珠，錢麗萍，周萍

（大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理671000）

西歸中阿魏酸和佛手柑內(nèi)酯提取工藝研究

孫幫燕，張海珠，錢麗萍，周萍*

（大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理671000）

目的：優(yōu)選西歸中阿魏酸和佛手柑內(nèi)酯的提取工藝。方法：采用超聲提取，分別通過單因素試驗(yàn)和L9（34）正交試驗(yàn)，研究了提取次數(shù)、提取時(shí)間、提取溫度和固液比四個(gè)因素對阿魏酸和佛手柑內(nèi)酯含量的影響。結(jié)果：最佳提取工藝為A3B2C1D2，即提取次數(shù)為3次，提取時(shí)間為50 min，提取溫度為55℃，固液比為1∶5。結(jié)論：該工藝簡便、可靠，可為西歸的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。［關(guān)鍵詞］西歸；阿魏酸；佛手柑內(nèi)酯；提取工藝

西歸（Seselopsis）是傘形科植物西藏凹乳芹（Vicatia thibertica de Boiss）的干燥根〔1〕，國內(nèi)主要分布于云南西北部、四川西部及西藏等地，云南省大理市鶴慶縣有悠久的栽培歷史，民間常作為滋補(bǔ)蔬菜燉肉、燉雞等食用。西歸中含有阿魏酸、佛手柑內(nèi)酯等八種生物活性成分〔2〕。阿魏酸具有抗血栓、抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗自由基等作用，其含量常作為評價(jià)一些中藥材及中藥制劑質(zhì)量的指標(biāo)〔3-4〕；佛手柑內(nèi)酯主要用于殺滅釘螺，有一定抗凝血作用，能止血、降壓和抗微生物活性〔5〕。目前有關(guān)西歸提取工藝研究有總黃酮、多糖、總氨基酸的報(bào)道〔6-9〕，本文考察了西歸中阿魏酸和佛手柑內(nèi)酯兩種成分的提取工藝（HPLC法測定西歸中阿魏酸和佛手柑內(nèi)酯的研究內(nèi)容本課題組已另文報(bào)道），為后續(xù)的研究及充分利用西歸資源提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器Agilent 1200高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；AE240電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；SK5200H超聲波清洗儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器（上海亞榮生化儀器廠）；DFY-200搖擺式高速萬能粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）。

1.2 試藥阿魏酸對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110773-201012，純度>99.6%）；佛手柑內(nèi)酯對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：201104，純度>98%）；甲醇（色譜純），水為超純水，其余試劑均為分析純。西歸購自云南省大理州鶴慶縣，經(jīng)大理學(xué)院生藥學(xué)教研室周濃副教授鑒定為西藏凹乳芹（Vicatia thibertica de Boiss）的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱：PhenomeneX Gemini-NX C18110A柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脫程序：65%~65%B（0~3 min），65%~60%B（3~10 min）；60%~55%B（10~15 min），55%~45%B（15~20 min）；流速：1 mL/min；檢測波長322 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 樣品溶液的制備精密稱取西歸樣品2.0 g，置50mL燒瓶中，加入10 mL乙酸乙酯，常溫下超聲30 min，提取1次，過濾，濾液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，蒸干溶劑，殘?jiān)眠m量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶，定容至刻度，即得樣品溶液，0.45 μm微孔濾膜濾過，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件操作，外標(biāo)法計(jì)算樣品溶液中阿魏酸和佛手柑內(nèi)酯的含量。

2.3 提取工藝考察

2.3.1 單因素考察

2.3.1.1 提取次數(shù)對含量的影響精密稱取西歸2.0 g，加乙酸乙酯10 mL，提取溫度30℃，超聲30 min，分別提取1、2、3、4次，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件操作，測定阿魏酸和佛手柑內(nèi)酯的含量，見圖1。

圖1 提取次數(shù)對含量的影響

由圖1可以得知，西歸中阿魏酸和佛手柑內(nèi)酯兩者提取2次時(shí)含量最高，因此，兩者的最佳提取次數(shù)為2次。

2.3.1.2 提取溫度對含量的影響精密稱取西歸2.0 g，加乙酸乙酯10 mL，超聲30 min，提取2次，分別在50、60、70、80℃下提取，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件操作，測定阿魏酸和佛手柑內(nèi)酯的含量，見圖2。

圖2 提取溫度對含量的影響

由圖2可以得知，在50~80℃之間，溫度越高，阿魏酸的含量越大，70℃與80℃相比，含量無顯著增加；而佛手柑內(nèi)酯的含量在70℃之后卻下降。因此，兩者的最佳提取溫度為70℃。

2.3.1.3 提取時(shí)間對含量的影響精密稱取西歸2.0 g，加乙酸乙酯10 mL，提取溫度70℃，提取2次，分別超聲30、40、50、60 min，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件操作，測定阿魏酸和佛手柑內(nèi)酯的含量，見圖3。

圖3 提取時(shí)間對含量的影響

由圖3可以得知，兩者的含量均隨著提取時(shí)間的延長而增大，因此，最佳提取時(shí)間為60 min。

2.3.1.4 固液比對含量的影響精密稱取西歸2.0 g，提取溫度70℃，超聲30 min，提取2次，固液比分別為1∶5、1∶6、1∶7、1∶8，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件操作，測定阿魏酸和佛手柑內(nèi)酯的含量，見圖4。

由圖4可以得知，隨著固液比的增大，兩者的含量減小，可能是因?yàn)樵?∶5時(shí)，固液比已經(jīng)達(dá)到飽和，繼續(xù)加大溶劑的量反而稀釋了溶液。因此，最佳固液比為1∶5。

圖4 固液比對含量的影響

由以上結(jié)果可以得知，提取時(shí)間、提取溫度、提取次數(shù)、固液比均影響阿魏酸和佛手柑內(nèi)酯的含量，單因素試驗(yàn)得出的最佳提取條件為：提取時(shí)間為60 min，提取溫度為70℃，提取次數(shù)為2次，固液比為1∶5。

2.3.2 正交試驗(yàn)為進(jìn)一步優(yōu)化兩種成分的提取工藝，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選取了4個(gè)因素：提取次數(shù)（A）、提取時(shí)間（B）、提取溫度（C）、固液比（D），采用L9（34）正交表進(jìn)行了正交試驗(yàn)，見表1、2。

表1 試驗(yàn)因素水平

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可以得知：對阿魏酸含量產(chǎn)生影響的各因素為B（提取時(shí)間）>D（固液比）>A（提取次數(shù)）>C（提取溫度），最佳提取工藝是A3B2C1D2。對佛手柑內(nèi)酯含量產(chǎn)生影響的各因素主次為D（固液比）>B（提取時(shí)間）>A（提取次數(shù)）>C（提取溫度），最佳提取工藝是A1B2C3D2，因佛手柑內(nèi)酯在A1、A3，C1、C3兩條件下的提取效果差異不大，考慮兩種成分的提取效率，選擇A3B2C1D2作為兩者的最佳提取工藝，即提取次數(shù)為3次，提取時(shí)間為50 min，提取溫度為55℃，固液比為1∶5。

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn)在上述正交試驗(yàn)的最佳條件下平行3次試驗(yàn)，得到的結(jié)果是：阿魏酸的含量分別為0.156 9 mg/g、0.160 2 mg/g、0.158 8 mg/g，RSD為1.04%；佛手柑內(nèi)酯的含量分別為0.089 8 mg/g、0.090 1 mg/g、0.088 3 mg/g，RSD為1.08%，說明該提取工藝合理、可靠。

3 討論

有文獻(xiàn)〔10〕報(bào)道，用一定體積分?jǐn)?shù)的甲醇及乙醇提取西歸中阿魏酸具有很好的效果，本實(shí)驗(yàn)通過用甲醇、乙醇和乙酸乙酯在相同條件下進(jìn)行提取，結(jié)果表明，用乙酸乙酯提取阿魏酸和佛手柑內(nèi)酯的效果最好。

實(shí)驗(yàn)比較了超聲和回流提取兩種方法，加熱回流提取方法對所測成分的提取效率高，因兩種提取方法測得含量差別不大，故選擇簡單、易操作且節(jié)約試劑的超聲提取法。優(yōu)化得到的西歸中阿魏酸和佛手柑內(nèi)酯提取工藝可以為西歸資源的進(jìn)一步開發(fā)利用和研究提供參考。

〔1〕周濃，段意梅，陳強(qiáng)，等.白族藥西歸的生藥學(xué)鑒定〔J〕.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（8）：2307，2425.

〔2〕張維明，段志紅，孫鳳，等.西歸的化學(xué)成分研究〔J〕.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2004，16（3）：218-219.

〔3〕金汝城，李貴文，馬素麗，等.當(dāng)歸中阿魏酸提取工藝的優(yōu)化研究〔J〕.中成藥，2008，30（4）：516-519.

〔4〕金月，李江.RP-HPLC法測定川芎藥材中阿魏酸的含量〔J〕.西北藥學(xué)雜志，2010，25（2）：85-87.

〔5〕劉慶，王成軍.西歸應(yīng)用研究進(jìn)展〔J〕.中國藥業(yè)，2008，17（8）：62.

〔6〕周萍，王成軍，張海珠.西歸總黃酮提取及含量測定〔J〕.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（4）：2053-2054.

〔7〕許嘉強(qiáng)，孫進(jìn)，李艷，等.西歸多糖的提取及含量測定研究〔J〕.大理學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，8（10）：15-17.

〔8〕周萍，王成軍，張海珠.西歸中多糖的提取及含量測定〔J〕.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2010，21（9）：2210-2211.

〔9〕梁英麗，李艷，高孟婷，等.西歸中總氨基酸含量測定方法研究〔J〕.大理學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，8（10）：7-9.

〔10〕肖培云，楊永壽，劉光明.白族藥西歸中阿魏酸的含量測定〔J〕.云南中醫(yī)中藥雜志，2007，28（12）：29-30.

（責(zé)任編輯 李楊）

Study on Extraction Process of Ferulic Acid and Bergapten from Seselopsis

SUN Bangyan,ZHANG Haizhu,QIAN Liping,ZHOU Ping*
（College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To explore the extraction process of ferulic acid and bergapten from seselopsis.Methods:Ferulic acid and bergapten were extracted by supersonic wave method.Under optimized by single element and L9（34）orthogonal experiment,we investigated the relationships of extract content with the number of extraction times,extraction time,ratio of raw material to liquid and temperature.Results:The optimal extraction process was A3B2C1D2,refluxing and extracting for 3 times at 55℃,50 minute per time, ratio of raw material to liquid at 1∶5.Conclusion:The optimal extraction process is simple and reliable,and it serves as reference for further development and utilization of seselopsis.

seselopsis;ferulic acid;bergapten;extraction process

R284.2

A

1672-2345（2013）06-0017-03

10.3969/j.issn.1672-2345.2013.06.005

大理學(xué)院大學(xué)生科研基金資助項(xiàng)目（KYSX2011069）

2013-01-31

孫幫燕，藥學(xué)專業(yè)2009級(jí)本科生. *通信作者：周萍，教授.