陳艷蘭，楊云川，王成軍，鄧水來，周萍

（大理學(xué)院，云南大理671000）

苦瓜酒中皂苷的含量測定

陳艷蘭，楊云川，王成軍，鄧水來，周萍*

（大理學(xué)院，云南大理671000）

目的：測定苦瓜酒中皂苷的含量。方法：以人參皂苷和β-谷甾醇為對照品，香草醛-高氯酸分光度法測定皂苷含量。結(jié)果：人參皂苷在0.030~0.240 mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 1），平均加樣回收率為99.6%，RSD=2.5%（n=6），樣品含量在0.151 1～0.563 0 mg；β-谷甾醇在0.015~0.116 mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 3），平均加樣回收率為100.9%，RSD=2.6%（n=6），樣品含量在0.065 6～0.247 9 mg。結(jié)論：β-谷甾醇和人參皂苷均可作為測定苦瓜皂苷含量的對照品，方法準(zhǔn)確可靠，可用于苦瓜酒的質(zhì)量控制。

紫外分光光度法；苦瓜皂苷；含量測定

苦瓜（Morrnordica charantia L.）為葫蘆科植物，一年生攀緣草本。明代醫(yī)藥學(xué)家李時珍說：“苦瓜氣味苦，寒，無毒，具有除邪熱，解勞乏，清心明目之功效”?？喙喜粌H是蔬菜，也可藥用，歷來是備受廣大消費(fèi)者青睞的保健品，對機(jī)體無明顯毒副作用〔1〕?？喙现械闹饕行С煞种皇强喙显碥?，主要包括甾體類皂苷和三萜類皂苷兩種。現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)研究表明苦瓜皂苷具有降血糖、抗腫瘤、抗病毒、抗生育、抗菌、抗氧化和抗炎等作用〔2〕。近幾年苦瓜被加工為低糖苦瓜蜜餞、苦瓜酸豆奶、苦瓜茶、苦瓜保健飲品、苦瓜啤酒等，其開發(fā)前景極為廣闊。苦瓜在白酒中浸泡，其有效成分均可融于酒中。本論文通過測定苦瓜酒中總皂苷的含量，評價苦瓜酒質(zhì)量，為苦瓜酒的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 儀器與試劑

TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；人參總皂苷標(biāo)準(zhǔn)品（惠州市東方植物保健科技有限公司，批號：20070516，含量：98.0%）；β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品（南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，含量：98.0%）；冰乙酸，高氯酸，香草醛和乙醇均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的配制

2.1.1 人參皂苷對照品溶液的配制精密稱取干燥至恒重的人參皂苷對照品0.600 0 g置100 mL量瓶中，用無水乙醇溶解，定容，即得6 mg/mL對照品儲備液。精密量取儲備液5 mL至50 mL量瓶中，無水乙醇定容，即得0.6 mg/mL對照品溶液。

2.1.2 β-谷甾醇對照溶液的配制精密稱取干燥至恒重的β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品0.290 0 g置100 mL量瓶中，用無水乙醇溶解，定容，即得2.9 mg/mL對照品儲備液。精密量取儲備液5 mL至50 mL量瓶中，無水乙醇定容，即得0.29 mg/mL的對照品溶液。

2.1.3 樣品溶液制備將不同生長時間的苦瓜浸泡于約60%的食用白酒中，浸泡不同時間，編號分別為1號：200606，2號：20070715，3號：20070815，4號：20080826，5號：200906，6號：201007。

2.2 最大吸收波長的選擇分別取人參皂苷對照液、β-谷甾醇對照液各0.2 mL，樣品液0.3 mL置具塞試管中，水浴揮干溶劑，加5%的香草醛-冰乙酸溶液0.3 mL和高氯酸0.5 mL搖勻，于70℃水浴加熱30 min，取出水浴冷卻至室溫，加冰乙酸5 mL搖勻，靜置15 min。以試劑空白為參比，于390~750 nm波長范圍內(nèi)掃描，見圖1。本研究確定人參皂苷對照品測定波長為548 nm，β-谷甾醇對照品測定波長為552 nm。

圖1 光譜掃描曲線

2.3 試驗(yàn)條件考察本試驗(yàn)對高氯酸用量，5%香草醛-冰乙酸用量，水浴溫度，水浴時間，冰乙酸用量和加冰乙酸后放置時間等6個因素進(jìn)行考察〔3-5〕。

2.3.1 高氯酸用量考察樣品按照“2.2”項(xiàng)下，依次加入0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL高氯酸，處理后分別在548、552 nm測定吸光度值。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在高氯酸用量為0.5 mL時，人參皂苷和β-谷甾醇對照液的吸光度均最高，故選擇高氯酸用量為0.5 mL。

2.3.25 %香草醛-冰乙酸用量考察樣品按照“2.2”項(xiàng)下，依次加入5%香草醛-冰乙酸溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，處理后分別在548、552 nm測定吸光度值。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在5%香草醛-冰乙酸用量為0.3 mL時，人參皂苷和β-谷甾醇對照液的吸光度值均最大，故選擇5%香草醛-冰乙酸用量0.3 mL。

2.3.3 水浴溫度考察樣品按照“2.2”項(xiàng)下，分別于室溫40、50、60、70、80℃水浴加熱15 min，處理后分別在548、552 nm測定吸光度值。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，人參皂苷對照液的吸光度值隨水浴溫度的增加而增加，而β-谷甾醇對照液在70℃時有最大吸收，為在相同條件下比較，本實(shí)驗(yàn)選擇70℃的水浴溫度。

2.3.4 水浴時間考察樣品按照“2.2”項(xiàng)下，于70℃水浴加熱5、10、15、20、25、30 min，處理后分別在548、552 nm測定吸光度值。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，β-谷甾醇對照液的吸光度值隨水浴時間的增加而增加，人參皂苷對照液水浴15 min后吸光度值變化趨勢不明顯。為在相同條件下比較，本實(shí)驗(yàn)選擇70℃水浴30 min后測吸光度值。

2.3.5 冰乙酸用量考察樣品按照“2.2”項(xiàng)下，依次加冰乙酸3、4、5、6、7、8 mL，處理后分別在548、552 nm測定吸光度值。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，隨冰乙酸體積的增加，人參皂苷和β-谷甾醇對照液的吸光度值均逐漸減小，5 mL后下降趨勢較平緩，所以選擇冰乙酸用量5 mL。

2.3.6 加冰乙酸后放置時間考察樣品按照“2.2”項(xiàng)下，加冰乙酸5 mL搖勻，放置5、10、15、20、25、30 min，處理后分別在548、552 nm測定其吸光度值。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在加冰乙酸放置15 min后人參皂苷和β-谷甾醇吸光度變化不大，故本實(shí)驗(yàn)選擇加冰乙酸后放置15 min測吸光度。

由上述考察結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)所用條件為：5%香草醛-冰乙酸溶液的用量0.3 mL，高氯酸的體積0.5 mL，70℃水浴加熱30 min，冰乙酸的體積為5 mL，加冰乙酸后放置15 min測定吸光度。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.4.1 人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密量取0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mL人參皂苷對照液，分別置10 mL具塞試管中，水浴揮干溶劑，照“2.2”項(xiàng)下方法處理并在548 nm處測定吸光度。以吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：Y=4.297 8X-0.014 4（r=0.999 1），線性范圍為0.030~0.240 mg。

2.4.2 β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密吸取0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mL β-谷甾醇對照液，分別置10 mL具塞試管中，水浴揮干溶劑，照“2.2”項(xiàng)下方法處理并在552 nm處測定吸光度。以吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：Y=9.850 6X-0.013（r=0.999 3），線性范圍為0.015~0.116 mg。

2.5 儀器精密度試驗(yàn)分別精密吸取0.2 mL人參皂苷對照液和β-谷甾醇對照液，照“2.2”項(xiàng)下處理后，分別在波長548、552 nm處連續(xù)測量6次，所得吸光度值RSD分別為0.10%，0.06%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.6 顯色穩(wěn)定性試驗(yàn)分別精密吸取1號樣品0.2 mL 6份，照“2.2”項(xiàng)下處理，分別在波長548、552 nm處，于5、15、30、60、90、120 min測吸光度，所得吸光度值RSD分別為2.3%，2.2%。結(jié)果表明樣品在120 min內(nèi)顯色穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)分別精密吸取1號樣品0.2 mL 6份，照“2.2”項(xiàng)下處理，分別在波長548、552 nm處測吸光度，計(jì)算苦瓜皂苷含量。以β-谷甾醇為對照，樣品含量為0.069 6 mg，RSD=0.72%；以人參皂苷為對照，樣品含量為0.164 6 mg，RSD=0.83%。

2.8 回收率試驗(yàn)分別精密吸取1號樣品0.1 mL，加入β-谷甾醇對照液、人參皂苷對照液各0.1 mL，照“2.2”項(xiàng)下處理后，分別在波長548、552 nm處測吸光度。結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.9 樣品含量測定取各樣品液適量，稀釋后精密吸取0.2 mL置具塞試管中，水浴揮干溶劑，照“2.2”中的步驟進(jìn)行。分別在548、552 nm測定吸光度值，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定（n=3）

3 討論

3.1 顯色方法的選擇文獻(xiàn)報道測定皂苷含量的顯色方法主要有香草醛-濃硫酸法、濃硫酸法、香草醛-高氯酸法〔6-7〕。由實(shí)驗(yàn)考察可知，香草醛-濃硫酸法顯色穩(wěn)定性和精密度不優(yōu)于其余兩種方法；濃硫酸法雖顯色穩(wěn)定性好，但測定非純皂苷含量時，其他成分可使皂苷含量結(jié)果誤差較大；香草醛-高氯酸法對樣品中糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)造成的誤差較小。本實(shí)驗(yàn)測定苦瓜粗提物中總皂苷，未分離糖、蛋白質(zhì)等干擾組分，因此采用香草醛-高氯酸顯色法。

3.2 測定波長的選擇分光光度法測定物質(zhì)含量是較為廣泛的方法，測定波長選擇不當(dāng)會導(dǎo)致測定結(jié)果不準(zhǔn)確。本研究中人參皂苷對照品和β-谷甾醇對照品分別在548、552 nm處有最大吸收，而樣品在558 nm有較大吸收。本研究以人參皂苷為對照品測定樣品時波長為548 nm，以β-谷甾醇為對照品測定樣品時波長為552 nm。

3.3 對照品的選擇通過方法學(xué)考查，β-谷甾醇和人參皂苷均可作為測定苦瓜皂苷含量的對照品。從實(shí)驗(yàn)可知β-谷甾醇對照品的最大吸收波長與樣品的最大吸收波長更接近，建議在測定苦瓜酒中皂苷含量時選擇β-谷甾醇為對照品。

3.4 樣品含量的差異從表2可知，苦瓜酒樣品中皂苷含量有所差異，這與苦瓜的生長時間和浸泡時間長短等因素有關(guān)，不同生長時間對苦瓜皂苷的含量存在很大的影響，生長成熟的苦瓜皂苷含量最大。從實(shí)驗(yàn)可知苦瓜生長成熟后浸泡2年為最佳浸泡時間，超過最佳浸泡時間其含量逐漸降低。

〔1〕劉秀英，胡怡秀，馬征，等.苦瓜醇提取物亞急性經(jīng)口毒性研究〔J〕.中國熱帶醫(yī)學(xué)，2010，10（5）：573-574.

〔2〕何啟平.苦瓜的化學(xué)成分及綜合利用〔J〕.河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，13（2）：157-159.

〔3〕鄧敏航，黃和，何碧銀，等.苦瓜活性成分提取工藝研究〔J〕.廣西熱帶農(nóng)業(yè)，2010（5）：7-11.

〔4〕周嬋媛，陳華國，周欣，等.紫外分光光度法測定吉祥草中的總皂苷〔J〕.華西藥學(xué)雜志，2010，25（3）：344-346.

〔5〕黃敏珠，王棟，尹忠臣，等.紫外分光光度法測絞股藍(lán)片中絞股藍(lán)總苷的含量〔J〕.中國中藥雜志，2010，35（18）：2410-2411.

〔6〕張中偉，謝明勇，王遠(yuǎn)興，等.比色法測定苦瓜總皂苷〔J〕.南昌大學(xué)學(xué)報：理科版，2005，29（5）：447-449.

〔7〕李健，任惠峰，陳姝娟，等.微波輔助萃取苦瓜總皂苷工藝研究〔J〕.中國食品學(xué)報，2009，9（3）：78-82.

（責(zé)任編輯 袁霞）

Content Determination of Momordicoside in Morrnordica charantia L.Wine

CHEN Yanlan,YANG Yunchuan,WANG Chengjun,DENG Shuilai,ZHOU Ping*
（Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To determine the content of the momordicoside in Morrnordica charantia L.wine.Methods:Vanillinperchloric acid colorimetry was applied to determine the contents of the total saponin in Morrnordica charantia L.wine,ginsenoside and β-sitosterol were used as the reference substance.Results:The concentration of ginsenoside had good linearity in the range of 0.030-0.240 mg（r=0.999 1）.The average recovery rate was 99.6%,RSD=2.5%（n=6）,the content of sample was 0.151 1-0.563 0 mg. The concentration of β-sitosterol had good linearity in the range of 0.015-0.116 mg（r=0.999 3）.The average recovery was 100.9%，RSD=2.6%（n=6）,the content of sample was 0.065 6-0.247 9 mg.Conclusion:β-sitosterol and ginsenoside are suitable for reference substance to determine the content of saponin in Morrnordica charantia L.wine.The method was accurate which could be used for the quality control of Morrnordica charantia L.Wine.

UV;momordicoside;contents determination

R931.6

A

1672-2345（2013）06-0023-04

10.3969/j.issn.1672-2345.2013.06.007

大理學(xué)院應(yīng)用開發(fā)研究基金資助項(xiàng)目（KYYY200904）；大理市科技基金資助項(xiàng)目（DLKJ201001）

2013-01-11

2013-03-08

陳艷蘭，教授，主要從事學(xué)位與研究生教育管理研究. *通信作者：周萍，教授.