谷曉霞, 趙祖嶺, 周 蕓, 楊秀秀, 黃孝帥, 薛圣杰

(皖南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院,安徽 蕪湖 241002)

席夫堿的C=N鍵上的氮原子含有孤對電子,易與金屬離子配位形成穩(wěn)定的金屬配合物,是良好的有機(jī)配體[1-2],廣泛應(yīng)用于抗菌[3-6]、抗病毒[7-9]、抗腫瘤[10-13]等領(lǐng)域。鄰香草醛本身即具有一定的抗菌能力,而過渡金屬也具有較強(qiáng)的抑菌能力,并且部分金屬離子與人體有較強(qiáng)的兼容性,利用這些金屬離子和鄰香草醛席夫堿配合反應(yīng),生成的配合物,其抗菌能力非常顯著。

近年來,研究人員發(fā)現(xiàn)鄰香草醛類席夫堿及其金屬配合物在抗菌[14-17]、抗腫瘤[18]方面均有較好表現(xiàn)。例如,嚴(yán)振寰等報道了鄰香草醛與丙氨酸所形成的席夫堿配體及其Cu(Ⅱ), Zn(Ⅱ), Ni(Ⅱ)的配合物,化合物中除了銅配合物對白色念珠球菌,鎳配合物對新型隱球菌無殺菌作用外,其它化合物在試驗條件下對兩種真菌均有抑制作用[19]。李幸群等報道了鄰香草醛與丙氨酸所形成的席夫堿鉀鹽,及其Cu(Ⅱ), Zn(Ⅱ), Ni(Ⅱ)配合物對白色念珠球菌和新型隱球菌有殺菌作用[20]。

目前,鄰香草醛縮芳香胺席夫堿及其過渡金屬配合物的抑菌活性方面的報道較少。鄰甲氧基苯胺,不僅易于鄰香草醛反應(yīng)成席夫堿,且甲氧基中氧原子也可以與金屬配位?？梢?鄰香草醛縮鄰甲氧基苯胺席夫堿是一種多齒配體,有利于穩(wěn)定金屬離子。鑒于此,本文設(shè)計、合成了鄰香草醛縮鄰甲氧基苯胺席夫堿,并進(jìn)一步采用液相擴(kuò)散法,將鄰香草醛縮鄰甲氧基苯胺席夫堿和六水合硫酸鎳進(jìn)行反應(yīng),合成了鄰香草醛席夫堿鎳的配合物(Scheme 1～2)。本文還進(jìn)一步探索了鄰香草醛縮鄰甲氧基苯胺席夫堿及其鎳配合物對于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及白色念珠菌的抗菌活性,以期為研發(fā)具有良好抗菌活性的化合物提供借鑒。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

WRS-3型顯微熔點儀;UV-5900PC型紫外可見分光光度計;Nicolet IS5型傅里葉變換紅外光譜儀;Bruker APEX-II CCD型單晶X-射線衍射儀;Elementar Vario EL III型全自動元素分析儀;Bruker 400 MHz型核磁共振儀(TMS為內(nèi)標(biāo));Thermo Scientific Q Exactive型四極桿質(zhì)譜儀;SW-CJ-1D型單人凈化工作臺；DSX-30L型手提式高壓蒸汽滅菌器;Thermo Heratherm IMH 100型恒溫培養(yǎng)箱。

鄰香草醛、鄰甲氧基苯胺、NiSO4·6H2O,上海阿拉丁試劑有限公司;其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1) 鄰香草醛縮鄰甲氧基苯胺席夫堿的合成

稱取鄰香草醛(3.043 g, 0.02 mol)與鄰甲氧基苯胺(2.239 mL, 0.02 mol)加入250 mL三頸瓶中,加入無水乙醇50 mL,攪拌至完全溶解,于室溫反應(yīng)至終點(TLC示蹤)。除去溶劑,獲得橘色固體,用乙醇重結(jié)晶得橘色晶體鄰香草醛縮鄰甲氧基苯胺席夫堿(簡稱鄰香草醛席夫堿)3.600 g。

鄰香草醛席夫堿: 產(chǎn)率70%, m.p.86.7～87.7 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 14.46(s, 1H, OH), 8.70(s, 1H, CH=N), 7.27～7.21(m, 2H, ArH), 6.98(dd,J=17.4 Hz, 8.1 Hz, 4H, ArH), 6.84(t,J=7.9 Hz, 1H, ArH), 3.93(s, 3H, OCH3), 3.89(s, 3H, OCH3);13C NMR(100 MHz, CDCl3)δ: 161.2(CH=N), 153.1(C—OH), 152.7(C—OCH3), 148.7(C—OCH3), 136.1(ArC), 128.1(ArC), 123.5(ArC), 120.9(ArC), 119.2, 119.0(ArC), 118.0(ArC), 114.2(ArC), 111.9(ArC), 56.1(OCH3), 55.8(OCH3); HR-MS(ESI)m/z: calcd for C15H15NO3{[M+H]+}258.1085, found 258.1118; FT-IRν: 3455w, 3062w, 3014w, 2995w, 2967w, 2836w, 1613s, 1496m, 1478m, 1458s, 1444m, 1404w, 1251s, 1023m, 782m, 743m cm-1。

(2) 鄰香草醛席夫堿鎳配合物的合成

稱取NiSO4·6H2O(0.066 g, 0.00025 mol)溶于無水甲醇中,再稱取鄰香草醛席夫堿(0.129 g, 0.0005 mol)溶于三氯甲烷中,先將溶解配體的三氯甲烷溶液置于試管底部,再加入適量三乙胺,最后加入硫酸鎳的甲醇溶液,靜置7天可得鄰香草醛席夫堿鎳配合物,配合物為墨綠色晶體0.092 g,產(chǎn)率65%, m.p.237.1～238.1 ℃; Anal. Calcd for C30H28NiN2O6(CHCl3)0.3: C 62.01, H 4.88, N 4.80, found C 61.99, H 4.86, N 4.80; FT-IRν: 3423w, 2942w, 2833w, 1608s, 1585s, 1537m, 1489s, 1391m, 1341w, 1306w, 1251m,1190m, 1172m, 1120m, 1106w, 1052w, 1010w, 983w, 868w, 851w, 784w, 751m, 736m cm-1。

Scheme 1

Scheme 2

1.3 晶體結(jié)構(gòu)

取適宜尺寸晶體進(jìn)行單晶測試,應(yīng)用 SHELXTL-2014 程序包進(jìn)行解析[21-22]。晶體結(jié)構(gòu)由直接法解得,對全部非氫原子坐標(biāo)及其各向異性熱參數(shù)進(jìn)行全矩陣最小二乘法修正。精修得到的鄰香草醛席夫堿鎳配合物晶體學(xué)數(shù)據(jù)見表1,主要鍵長和鍵角見表2。配合物晶體數(shù)據(jù)已注冊于劍橋晶體數(shù)據(jù)庫中,CCDC: 2088248。

表1 配合物的主要晶體學(xué)數(shù)據(jù)

表2 鎳配合物的主要鍵長和鍵角

配合物的單晶結(jié)構(gòu)見圖1。由表1、表2和圖1可知,鎳配合物為正交晶系,空間群為P212121,配合物是由兩個配體和金屬離子配位。Ni2+與配體上的酚羥基氧原子,亞胺上的氮原子及鄰甲氧基苯胺中甲氧基上的氧原子發(fā)生配位,構(gòu)成的六配位變形的八面體。

圖1 鄰香草醛席夫堿鎳配合物的晶體結(jié)構(gòu)

1.4 抗菌活性測試方法

用LB培養(yǎng)基干粉配制一定量的培養(yǎng)基溶液,高壓滅菌冷卻后倒平板冷卻;另取100 mL液體沙氏培養(yǎng)基和2.5 g瓊脂粉配制培養(yǎng)基溶液,經(jīng)過高壓滅菌冷卻后倒平板冷卻。以DMSO為溶劑,將鄰香草醛席夫堿(1)、鄰香草醛席夫堿鎳配合物(2)、鄰香草醛(3)分別配制成0.0125 mol·L-1、 0.025 mol·L-1、 0.05 mol·L-1、 0.10 mol·L-1、 0.20 mol·L-1的溶液備用。采用紙片法,進(jìn)行目標(biāo)化合物的體外抑菌活性實驗。具體操作如下：采用密集劃線法將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌接種在含有瓊脂的固體培養(yǎng)基上。分別在直徑為6 mm的已滅菌濾紙片上滴加20 μL濃度分別為0.0125 mol·L-1、 0.025 mol·L-1、 0.05 mol·L-1、 0.10 mol·L-1、 0.20 mol·L-1的上述5種不同濃度溶液,放置在37 ℃烘箱烘干,然后在每個菌種的培養(yǎng)皿的不同區(qū)域分別貼上已烘干的相同濃度上述3個不同溶液的濾紙片(1, 2, 3)及空白濾紙片(4),于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后觀察細(xì)菌生長情況,以得出抗菌實驗結(jié)果。平行做3組相同的實驗,求出抑菌圈直徑的平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外分析

配制1×10-5mol·L-1鄰香草醛縮鄰甲氧基苯胺和鄰香草醛縮鄰甲氧基苯胺席夫堿鎳配合物的DMSO溶液。鄰香草醛縮鄰甲氧基苯胺紫外吸收光譜如圖2所示。由圖2可知,波長280 nm處特征峰為苯環(huán)的π→π*躍遷吸收峰,波長340 nm處為兩個苯環(huán)和席夫堿C=N構(gòu)成大共軛體系的π→π*躍遷吸收峰。在鄰香草醛縮鄰甲氧基苯胺鎳配合物的紫外吸收光譜圖中,受共軛體系增大影響,波長280 nm和波長340 nm的特征峰發(fā)生紅移,波長336 nm和451 nm處出現(xiàn)特征峰,這證實了金屬與配體成功發(fā)生了配位[14-15]。

λ/nm圖2 鄰香草醛縮鄰甲氧基苯胺席夫堿及其鎳配合物的紫外光譜圖

2.2 紅外分析

由紅外譜圖(圖略)可知,3455 cm-1處吸收峰為酚羥基峰,由于形成了氫鍵,出現(xiàn)了一條寬而鈍的吸收帶。3062 cm-1處吸收峰為吲哚環(huán)N—H的收縮振動,1496 cm-1、 1478 cm-1處吸收峰為取代苯環(huán)骨架振動吸收峰,743 cm-1處吸收峰為取代苯苯環(huán)的C—H面外彎曲振動吸收峰,說明取代方式為1,2-雙取代,782 cm-1處吸收峰為取代苯苯環(huán)的C—H面外彎曲振動吸收峰,說明出現(xiàn)了1,2,3-三取代,1251 cm-1處吸收峰為C—O—C伸縮振動吸收峰,說明有甲氧基存在。1613 cm-1處吸收峰為C=N伸縮振動吸收峰,說明有C=N形成。

分析配合物紅外數(shù)據(jù)可知,原來配體中C=N鍵的伸縮振動位于1613 cm-1,形成配合物以后,移動至1608 cm-1,表明配體中C=N鍵的氮原子與鎳離子配合成鍵,其雙鍵的吸收振動減弱。原來配體中羥基峰的波數(shù)為3455 cm-1,形成配合物后移動至3422 cm-1,。原來配體中1251 cm-1處吸收峰為C—O—C伸縮振動吸收峰,也表現(xiàn)出一定程度的減弱,說明配體甲氧基的氧原子參與了配位。

2.3 核磁分析

鄰香草醛席夫堿分子式為C15H15NO3,從氫譜上看H原子有7種類型,總積分面積為15,核磁氫類型相符。分析譜圖(圖略)可知,δ14.46出現(xiàn)的特征峰為酚羥基特征峰,δ3.93和δ3.89為甲氧基特征峰,圖中在δ8.70出現(xiàn)了CH=N-質(zhì)子類特征峰與目標(biāo)產(chǎn)物相吻合。從碳譜來看,圖中δ56.1和δ56.8為甲氧基特征峰。圖中δ161.2出現(xiàn)了CH=N-特征峰與目標(biāo)產(chǎn)物相吻合,其他特征峰與目標(biāo)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)相符。

2.3 抑菌活性

抗菌活性實驗結(jié)果見表3。由表3可知,鄰香草醛席夫堿及其鎳配合物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌均有一定的抑菌作用,且有一定的濃度依賴性。其中,當(dāng)溶液濃度達(dá)到0.20 mol·L-1時,鄰香草醛席夫堿和其鎳配合物兩者對白色念珠菌的抑菌圈直徑分別可達(dá)到34.10 mm、 35.40 mm,具有極度敏感,且兩者對白色念珠菌抑制活性都大于原料鄰香草醛的抑菌活性;對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的抑菌活性也體現(xiàn)出一定的濃度依賴性,但鄰香草醛席夫堿鎳配合物對這兩種菌的抑菌活性隨濃度先增后減,其中,在0.05 mol·L-1時,抑菌效果最好,能達(dá)到高度敏感。可見,引入亞胺基(C=N)對鄰香草醛的抑菌活性增強(qiáng)起到重要的作用,這符合生物活性疊加原理[23];有文獻(xiàn)報道Ni2+具有很好的抑菌活性[24],鄰香草醛席夫堿與金屬鎳離子配位形成配合物后,由于金屬鎳離子的協(xié)同作用,使其抑菌活性增強(qiáng),具體的抗菌機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。圖3為溶液溶度達(dá)到0.20 mol·L-1時,化合物對3種菌的抑制效果。

表3 鄰香草醛席夫堿、鎳配合物及鄰香草醛對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的抑菌直徑(mm)*

大腸桿菌效果圖

合成了鄰香草醛縮鄰甲氧基苯胺席夫堿,通過液相擴(kuò)散法獲得了鄰香草醛席夫堿鎳配合物,并采用紙片法研究了兩者的抗菌活性。結(jié)果表明,鄰香草醛席夫堿及其鎳配合物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及白色念珠菌均有較好的抑菌活性。其中,兩者對白色念珠菌的抑制效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果;鎳配合物的抗菌活性優(yōu)于鄰香草醛席夫堿。將鄰香草醛轉(zhuǎn)化成席夫堿后,抗菌活性顯著提高,與過渡金屬鎳配位后,抗菌活性更顯著。具體的抑菌機(jī)制正在研究之中。