孔令麒, 李美玲, 鄒秋萍, 孫 赟, 毛澤偉, 黃 豐

(云南中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院,云南 昆明 650500)

鴨嘴花堿(Vasicine)是從傣藥鴨嘴花(Adhatodavasica)中分離出的一種吡咯并[2,1-b]喹唑啉類生物堿[1]。鴨嘴花堿活性位點(diǎn)較多,與受體結(jié)合后表現(xiàn)出廣泛的生物活性,如抗炎、平喘、抗氧化和鎮(zhèn)咳等[2-3]。鑒于鴨嘴花堿低毒性的特點(diǎn),其在新藥研發(fā)方面表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景[4-6]。鴨嘴花堿分子中含有喹唑啉單元,根據(jù)活性片段拼合原理,將活性含氮雜環(huán)引入到分子中后,可能得到具有更優(yōu)藥理活性的衍生物。迄今為止,對(duì)鴨嘴花堿的研究主要集中在小分子催化領(lǐng)域[7-10],結(jié)構(gòu)修飾方面的報(bào)道較少[11-12]。

本文以活性天然產(chǎn)物鴨嘴花堿出發(fā),經(jīng)取代和Huisgen反應(yīng)合成了7個(gè)新型三唑取代的鴨嘴花堿衍生物(2a～2g, Scheme 1),其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和13C NMR表征。以地塞米松作陽(yáng)性對(duì)照,采用細(xì)菌脂多糖誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞Raw 264.7炎癥模型對(duì)其體外毒性和抗炎活性進(jìn)行了初步篩選。

Scheme 1

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Bruker AM 400 MHz型核磁共振儀(CDCl3為溶劑,TMS為內(nèi)標(biāo))；Epoch型連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀。

所有試劑均為市售化學(xué)純(上海泰坦科技,上海韶遠(yuǎn))；溶劑均為分析純(天津致遠(yuǎn)),DMF使用前經(jīng)干燥處理。

1.2 合成

(1) 化合物1的合成

稱取鴨嘴花堿(1.88 g, 10 mmol)加入100 mL二口瓶中,加入30 mL無(wú)水DMF,冰水浴冷卻,氮?dú)夥諊?攪拌下分批加入氫化鈉(60%, 0.8 g, 20 mmol),加畢,反應(yīng)1 h。加入丙炔溴(2.38 g, 20 mmol),于室溫反應(yīng)24 h(TLC檢測(cè))。緩慢滴加飽和氯化銨溶液淬滅反應(yīng),加入60 mL冷水,用二氯甲烷(3×20 mL)萃取,合并有機(jī)相,用無(wú)水硫酸鈉干燥,真空濃縮,殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：2%CH3OH-DCM)純化得淡黃色固體11.51 g,收率67%;1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 7.93(d,J=6.5 Hz, 1H), 7.48～7.43(m, 1H), 7.44～7.32(m, 1H), 7.21～7.10(m, 1H), 4.75～4.65(m, 1H), 4.41～4.31(m, 1H), 4.29(s, 2H), 3.99～3.68(m, 2H), 2.67～2.49(m, 1H), 2.46(t,J=2.4 Hz, 1H), 2.34～2.17(m, 1H), 2.10～1.90(m, 1H);13C NMRδ: 160.19, 156.74, 148.65, 133.81, 127.41, 126.58, 125.95, 125.67, 120.91, 79.84, 79.17, 75.49, 56.93, 48.22, 46.76, 43.67, 31.1, 27.63; HR-MS(ESI-TOF)m/z: calcd for C14H14N2O{[M+H]+}227.1179, found 227.1176。

(2) 衍生物2a～2g的合成

依次稱取化合物1(90 mg, 0.4 mmol)、五水硫酸銅(25 mg, 0.1 mmol)、疊氮化鈉(33 mg, 0.5 mmol)和抗壞血酸鈉(99 mg, 0.5 mmol)于25 mL圓底燒瓶中,加入乙醇水溶液(1:1, 5 mL)和0.5 mmol 鹵代物,65 ℃反應(yīng)12 h。 TLC檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束后,二氯甲烷萃取(3×10 mL),有機(jī)相用水(3×10 mL)洗滌后經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥,真空濃縮,殘余物以4%CH3OH-DCM為洗脫劑進(jìn)行柱層析分離得到目標(biāo)產(chǎn)物。

化合物2a: 收率74%;1H NMRδ: 8.28(d,J=8.6 Hz, 1H), 7.73～7.75(m, 2H), 7.63(s, 1H), 7.47～7.51(m, 1H), 7.34～7.38(m, 3H), 7.27～7.29(m, 2H), 5.57(s, 1H), 5.53(s, 2H), 5.32(s, 1H), 5.08(d,J=12.2 Hz, 1H), 4.95(d,J=12.2 Hz, 1H), 4.91～4.95(m, 1H), 4.18～4.24(m, 1H), 4.09～4.15(m, 1H), 2.47～2.56(m, 1H), 2.25～2.33(m, 1H);13C NMRδ:160.8, 157.1, 149.0, 144.7, 134.5, 134.2, 129.2, 128.9, 128.2, 127.8, 127.0, 126.4, 123.0, 121.3, 78.8, 63.3, 54.3, 44.0, 28.1。

化合物2b: 收率65%;1H NMRδ: 8.22～8.25(m, 1H), 7.67～7.68(m, 2H), 7.49(s, 1H), 7.41～7.45(m, 1H), 6.33～6.35(m, 3H), 5.36(s, 2H), 5.20(s, 2H), 5.02(d,J=12.2 Hz, 1H), 4.89(d,J=12.2 Hz, 1H), 4.83～4.86(dd,J=4.5 Hz, 4.2 Hz, 1H), 4.12～4.19(m, 1H), 4.03～4.09(m, 1H), 3.68(s, 6H), 2.39～2.48(m, 1H), 2.20～2.27(m, 1H);13C NMRδ: 161.5, 157.1, 149.1, 144.9, 136.7, 134.3, 127.9, 127.1, 126.6, 123.1, 106.4, 100.6, 78.9, 63.4, 55.6, 55.5, 44.1, 28.3； HR-MS(ESI-TOF)m/z: calcd for C23H25N5O3{[M+H]+}420.2030, found 420.1656。

化合物2c: 收率63%;1H NMRδ: 8.28(d,J=7.9 Hz, 1H), 7.71～7.73(m, 2H), 7.59(s, 1H), 7.45～7.49(m, 1H), 7.06～7.17(m, 2H), 6.09～7.02(m, 1H), 5.46(s, 2H), 5.25(s, 2H), 5.09(d,J=12.2 Hz, 1H), 4.96(d,J=12.2 Hz, 1H), 4.90～4.93(dd,J=4.5 Hz, 4.4 Hz, 1H), 4.17～4.24(m, 1H), 4.08～4.15(m, 1H), 2.47～2.56(m, 1H), 2.26～2.33(m, 1H);13C NMRδ: 160.8, 157.0, 151.9, 149.4, 149.3, 149.0, 145.2, 134.2, 131.5, 127.7, 127.0, 126.5, 124.4, 124.3, 123.0, 118.2, 118.0, 117.4, 117.3, 78.9, 63.3, 53.1, 44.0, 28.1； HRMS(ESI-TOF)m/z: calcd for C21H19F2N5O{[M+H]+}396.1630, found 396.1620。

化合物2d: 收率70%;1H NMRδ: 8.28(d,J=8.7 Hz, 1H), 7.69～7.75(m, 2H), 7.55(s, 1H), 7.45～7.49(m, 1H), 7.32(d,J=8.5 Hz, 2H), 7.20(d,J=8.6 Hz, 2H), 5.47(s, 2H), 5.27(s, 2H), 5.29(s, 1H), 5.08(d,J=12.2 Hz, 1H), 4.95(d,J=12.2 Hz, 1H), 4.89～4.91(dd,J=4.5 Hz, 4.1 Hz, 1H), 4.19～4.24(m, 1H), 4.08～4.14(m, 1H), 2.46～2.54(m, 1H), 2.25～2.32(m, 1H);13C NMRδ: 160.7, 157.0, 148.9, 134.8, 134.1, 133.0, 129.3, 127.7, 126.9, 126.3, 122.9, 78.8, 63.2, 53.4, 43.9, 28.0； HR-MS(ESI-TOF)m/z: calcd for C21H20ClN5O{[M+H]+}394.1429, found 394.1417。

化合物2e: 收率58%;1H NMRδ: 8.25(d,J=8.4 Hz, 1H), 7.66～7.72(m, 2H), 7.47(s, 1H), 7.40～7.44(m, 3H), 7.09(d,J=8.4 Hz, 2H), 5.40(s, 2H), 5.24(s, 2H), 5.02(d,J=12.2 Hz, 1H), 4.89(d,J=12.2 Hz, 1H), 4.83～4.86(m, 1H), 4.12～4.17(m, 1H), 4.04～4.10(m, 1H), 2.40～2.49(m, 1H), 2.20～2.28(m, 1H);13C NMRδ: 160.8, 156.9, 148.9, 145.0, 134.2, 133.4, 132.3, 129.8, 127.7, 127.0, 126.4, 123.0, 122.8, 121.3, 78.8, 63.2, 53.5, 44.0, 28.1。

化合物2f: 收率62%;1H NMRδ: 8.25(d,J=8.3 Hz, 1H), 7.65～7.69(m, 2H), 7.60(d,J=8.3 Hz, 2H), 7.52(s, 1H), 7.41～7.45(m, 1H), 7.29(d,J=8.0 Hz, 2H), 5.52(s, 2H), 5.23(s, 2H), 5.05(d,J=12.2 Hz, 1H), 4.91(d,J=12.2 Hz, 1H), 4.84～4.87(dd,J=4.0 Hz, 4.0 Hz, 1H), 4.13～4.20(m, 1H), 4.05～4.11(m, 1H), 2.41～2.50(m, 1H), 2.22-2.29(m, 1H);13C NMRδ: 160.9, 157.0, 149.1, 145.4, 139.7, 134.4, 133.1, 128.6, 127.8, 127.2, 126.6, 123.2, 113.1, 79.1, 63.3, 53.6, 44.1, 29.8, 28.2。

化合物2g: 收率60%;1H NMRδ: 8.29～8.31(m, 1H), 8.23(d,J=8.8 Hz, 2H), 7.72～7.75(m, 2H), 7.61(s, 1H), 7.47～7.51(m, 1H), 7.41(d,J=8.8 Hz, 2H), 5.63(s, 2H), 5.30(s, 2H), 5.12(d,J=12.3 Hz, 1H), 4.98(d,J=12.2 Hz, 1H), 4.91～4.93(dd,J=4.0 Hz, 4.0 Hz, 1H), 4.21～4.26(m, 1H), 4.12～4.18(m, 1H), 2.48～2.57(m, 1H), 2.28-2.36(m, 1H);13C NMRδ: 160.9, 157.0, 149.1, 145.5, 141.6, 134.4, 128.8, 127.8, 127.2, 126.6, 124.5, 123.2, 79.1, 63.3, 44.2, 28.2。

1.3 細(xì)胞增值抑制實(shí)驗(yàn)

將凍存的RAW 264.7細(xì)胞迅速解凍后吸入含10 mL DMEM培養(yǎng)基(含10%FBS, 1%雙抗)的培養(yǎng)皿中,放置于37 ℃、 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞傳代后,每個(gè)培養(yǎng)皿中加入5 mL左右PBS,按照細(xì)胞密度(1×105)稀釋。每孔加入100 μL細(xì)胞懸液后振蕩均勻,置于37 ℃、 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。吸出96孔板中的細(xì)胞懸液,每孔加入100 μL已配制好的不同濃度的樣品溶液(40、 20、 10、 5、 2.5、 1.25 μmol/L)。繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出96孔板,避光加入MTT(每孔10 μL),繼續(xù)放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h,棄上清液,每孔加入150 μL DMSO溶液。振蕩均勻,于490 nm處測(cè)定OD值,計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.4 抗炎活性測(cè)試

以地塞米松(Dexamethasone)為陽(yáng)性對(duì)照,采用細(xì)菌脂多糖(LPS)誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7炎癥模型評(píng)價(jià)化合物抑制NO產(chǎn)生的活性。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的RAW 264.7細(xì)胞(2×106個(gè)/mL,100 μL/孔)接種于96孔培養(yǎng)板中,設(shè)空白對(duì)照組,LPS模型組(加入終濃度為1.5 μg/mL的LPS),待測(cè)化合物組(同時(shí)加入藥物和終濃度為1.5 μg/mL的LPS),地塞米松組(終濃度為10 μmol/L地塞米松和終濃度為1.5 μg/mL LPS),于37 ℃, 5%CO2培養(yǎng)24 h,收集上清液,采用Griess法檢測(cè)NO含量,每次試驗(yàn)重復(fù)3次,計(jì)算IC50。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,1,3-偶極環(huán)加成反應(yīng)(Huisgen反應(yīng))的條件有很多[13-15],主要采用銅鹽催化,并加入抗壞血酸鈉,在混合溶劑中反應(yīng)。在合成目標(biāo)衍生物時(shí),對(duì)反應(yīng)條件(包括銅鹽和溶劑)進(jìn)行了篩選,結(jié)果見表1(以2a為例)。從表1中可以看出,催化劑和溶劑對(duì)反應(yīng)的影響較大。五水硫酸銅的催化效果最好,碘化亞銅次之,醋酸銅的催化效果最差。在篩選的3種溶劑體系中,DMF的反應(yīng)收率高于四氫呋喃和乙醇。原因可能跟化合物1在混合溶劑中的溶解性有關(guān)。優(yōu)化后,化合物2a的收率可達(dá)74%。

表1 Huisgen反應(yīng)條件篩選

2.2 抗炎活性

以地塞米松(Dexamethasone)為陽(yáng)性對(duì)照,采用細(xì)菌脂多糖誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞Raw 264.7模型初步測(cè)試了目標(biāo)產(chǎn)物的體外毒性和抗炎活性,結(jié)果見表2。從表2可以看出,合成的7個(gè)衍生物對(duì)巨噬細(xì)胞的毒性均較小(EC50>40 μM),化合物2b能夠較好抑制NO的生成(IC50=27.13 μM),且效果優(yōu)于鴨嘴花堿。分析衍生物的結(jié)構(gòu)可知,當(dāng)芐基苯環(huán)上帶有供電子基團(tuán)時(shí)抗炎活性較好(2b)；當(dāng)芐基上含有鹵素(2c～2e)或吸電子基團(tuán)(2f,2g)時(shí)活性降低。

表2 化合物的體外抗炎活性

對(duì)鴨嘴花堿進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造,合成了7個(gè)新型三唑取代衍生物?？寡谆钚越Y(jié)果顯示,三唑環(huán)上電子云密度越高,衍生物的抗炎活性可能越好。這為該化合物進(jìn)一步的構(gòu)效關(guān)系研究提供了參考。