徐曉梅 樊榮 黃曉穎 林乾頂 王良興

間歇缺氧大鼠NF-kBp65以及MCP-1的表達(dá)

徐曉梅 樊榮 黃曉穎 林乾頂 王良興

目的 探討間歇缺氧對(duì)大鼠血清以及心肌中NF-kBp65以及MCP-1含量的影響。 方法 清潔SD大鼠30只，隨機(jī)分成3組（每組10只）：正常對(duì)照組、間歇缺氧組、持續(xù)缺氧組，普通飼料飼養(yǎng)。正常對(duì)照組：常壓、常氧下飼養(yǎng)；間歇低氧組：每90s一循環(huán)，氧艙內(nèi)低氧濃度維持在6%～8%，持續(xù)10s以上；持續(xù)低氧組：氧艙內(nèi)氧濃度維持在8%～11%。每天早上9：00動(dòng)物入艙，至下午5：00試驗(yàn)結(jié)束，每天持續(xù)8h，連續(xù)35d。然后經(jīng)右頸動(dòng)脈抽血，處死大鼠分離其心臟，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）測(cè)定血清中NF-kBp65以及MCP-1含量，采用免疫印跡法測(cè)定大鼠心肌中NF-kBp65以及MCP-1的含量。 結(jié)果 與正常對(duì)照組相比，在間歇缺氧組以及持續(xù)缺氧組中大鼠血清以及心肌中NF-kBp65以及MCP-1的含量明顯增加。 結(jié)論 間歇缺氧可導(dǎo)致NF-kB的激活，從而導(dǎo)致大鼠血清以及心肌中NF-kBp65以及MCP-1的表達(dá)增加。

缺氧 心肌 NF-kBp65 MCP-1 大鼠

Hypoxia Heart muscle NF-kBp65 MCP-1 Rats

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（obstructive sleep apnea hyponea syndrome，OSAHS）以夜間反復(fù)發(fā)生的上氣道阻塞或狹窄而導(dǎo)致的間歇低氧血癥為臨床特征。研究發(fā)現(xiàn)，OSAHS是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。OSAHS似乎與系統(tǒng)性炎癥有關(guān)[1]，這可能是導(dǎo)致心血管疾病的機(jī)制之一，而系統(tǒng)性炎癥的中心環(huán)節(jié)則是核因子-kB（NF-kB）。NF-kB是調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)、凋亡和炎癥反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)。所以NF-kB激活可能是心血管疾病的始動(dòng)機(jī)制。而缺氧可導(dǎo)致NF-kB激活。因此我們推測(cè)OSAHS可能通過間歇缺氧導(dǎo)致NF-kB激活，引起系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)病率增加。

本研究模擬OSAHS患者的間歇缺氧狀態(tài)，測(cè)定間歇缺氧大鼠血清以及心肌中NF-kBp65以及單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）的含量，以明確缺氧狀態(tài)下炎癥蛋白的表達(dá)是否增加，進(jìn)而導(dǎo)致心血管疾病發(fā)病率增加。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 由溫州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物試驗(yàn)中心提供，共清潔SD雄性大鼠30只，按照體重相匹配隨機(jī)分為3組，每組10只。喂養(yǎng)均采用相同飼料，由溫州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物試驗(yàn)中心統(tǒng)一提供。正常對(duì)照組：常壓、常氧下飼養(yǎng)；間歇低氧組：每90s一循環(huán)，氧艙內(nèi)低氧濃度維持在6%～8%，持續(xù)10s以上；持續(xù)低氧組：氧艙內(nèi)氧濃度維持在8%～11%。每天早上9：00動(dòng)物入艙，至下午5：00試驗(yàn)結(jié)束，每天持續(xù)8h，連續(xù)35d。

1.2 方法 研究結(jié)束后經(jīng)頸內(nèi)靜脈抽血法處死大鼠快速沿右室壁分離大鼠的左、右心室，稱取重量后置入塑料管中置入液氮罐中固定，然后轉(zhuǎn)移至-80°C冰箱中保存。采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清NF-kBp65、MCP-1含量。采用免疫印跡法測(cè)定大鼠心肌中NF-kBp65以及MCP-1的含量。首先收集心肌細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入蛋白質(zhì)抽提試劑輕輕搖動(dòng)5min，加入裂解液，冰浴下?lián)u動(dòng)15min進(jìn)行裂解，14 000g離心15min，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，膜在5%BSA溶液中室溫孵育1h以封閉膜上的非特異結(jié)合。TBS/T洗膜3次，每次5min，封閉過的膜加入一級(jí)抗體4℃過夜，抗原抗體結(jié)合。TBS/T洗膜3次，每次5min，加入HRP標(biāo)記的二級(jí)抗體以結(jié)合一級(jí)抗體，室溫孵育膜1h。TBS/T洗膜3次，每次5min。將膜置于反應(yīng)液中室溫孵育5min。去除過量的溶液，將膜夾在兩塑料薄膜之間，以X線膠片曝光。圖片掃描保存為電腦文件。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用表示，采用非參數(shù)檢驗(yàn)符合正態(tài)分布，組間比較采用單因素方差分析，其中兩組間比較采用LSD法。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠血清中NF-kB以及MCP-1水平的比較 見表1。

表1 3組大鼠血清中NF-kB以及MCP-1水平的比較（ng/L）

由表1可見，與正常對(duì)照組比較，間歇缺氧組以及持續(xù)缺氧組大鼠血清中NF-kB以及MCP-1水平明顯升高，并且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），而間歇缺氧組以及持續(xù)缺氧組相比較，雖然間歇缺氧組比持續(xù)缺氧組血清NF-kB以及MCP-1水平表達(dá)有所增加，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 3組大鼠心肌中NF-kB以及MCP-1的表達(dá)電泳圖 見圖1、2。

圖1 3組大鼠心肌NF-kBp65的表達(dá)電泳圖（N:正常對(duì)照組；CH：持續(xù)缺氧組；IH：間歇缺氧組）

圖2 3組大鼠心肌MCP-1的表達(dá)電泳圖（注釋同圖1）

由圖1、2可見，在間歇缺氧組以及持續(xù)缺氧組中，大鼠心肌NF-kBp65以及MCP-1表達(dá)增加，尤以在間歇缺氧組中明顯。

3 討論

OSAHS以夜間反復(fù)發(fā)生的上氣道阻塞或狹窄而導(dǎo)致的間歇低氧血癥為臨床特征。研究發(fā)現(xiàn)，OSAHS是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。OSAHS似乎與系統(tǒng)性炎癥有關(guān)，這可能是導(dǎo)致心血管疾病的機(jī)制之一，而系統(tǒng)性炎癥的中心環(huán)節(jié)則是NF-kB。NF-kB是調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)、凋亡和炎癥反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)[2]。

NF-kB是參與免疫與炎癥反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，能被多種細(xì)胞外信號(hào)，包括缺氧所激活[3]。NF-kB迅速核移位，進(jìn)入核內(nèi)調(diào)節(jié)多種基因，包括多種細(xì)胞因子（TNF-a等）、急性時(shí)相蛋白（CRP）、黏附分子如細(xì)胞間黏附分子-1和血管內(nèi)皮黏附分子-1等、趨化因子如單核細(xì)胞趨化蛋白-1等的表達(dá)，參與炎癥反應(yīng)。

MCP-1屬于趨化因子家族中的C-C亞家族成員，單核細(xì)胞的趨化主要是由MCP-1來實(shí)現(xiàn)的，它能使血液中的單核細(xì)胞遷入內(nèi)膜下，活化為巨噬細(xì)胞，吞噬脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞，在動(dòng)脈粥樣硬化（artheroscleros,AS）的早期起著重要作用。同時(shí)，在AS發(fā)生后期，MCP-1對(duì)于促進(jìn)斑塊的不穩(wěn)定也發(fā)揮著作用。MCP-1可由體內(nèi)多種細(xì)胞分泌，包括平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等，它能趨化多種炎性細(xì)胞向病變部位聚集，并對(duì)多種炎癥因子的刺激作出應(yīng)答，從而直接或間接地參與了AS得形成。Martinovic等[4]對(duì)263例志愿者研究發(fā)現(xiàn)，血清MCP-1水平升高增加了冠狀A(yù)S的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

通過本研究發(fā)現(xiàn)，間歇缺氧確實(shí)可以使血清以及心肌中NF-kB以及MCP-1表達(dá)明顯增加，這可能是由于缺氧激活NF-kB成活化狀態(tài)，進(jìn)而再激活其它炎癥因子如MCP-1等，導(dǎo)致系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致缺氧狀態(tài)下心血管疾病發(fā)病率升高。這可能是OSAHS患者易發(fā)生心血管疾病的可能機(jī)制之一。

[1]Selmi C,Montano N,Furlan R,et al.Inflammation and oxidative stress in obstructive sleep apnea syndrome[J].Exp Biol Med, 2007,232(11):1409-1413.

[2]Williams A,Scharf S M.Obstructive sleep apnea,cardiovascular disease,and inflammation-is NF-kB the key[J]?Sleep Breath, 2007,11(2):69-76.

[3]Greenberq H,Ye X,Wilson D,et al.Chronic intermittent hypoxia activates nuclear factor-kappa B in cardiovascular tissues in vivo[J].Biochem Biophys Res Commun,2006,343(2):591-596.

[4]Martinovic I,Abegunewardene N,Seul M,et al.Elevated monocyte chemoattractaut protein-1 serum levels in patients at risk for cOr-onary artery disease[J].Circ J,2005,69(12):1484.

2011-12-12）

（本文編輯：沈昱平）

溫州市科技局資助項(xiàng)目（Y20090125）

325000 溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the expression of NF-kBp65 and MCP-1 in serum and heart muscle in intermittent hypoxia rats. Methods There are thirty SD rats were randomly assigned into three groups:control group,intermittent hypoxia group and continuing hypoxia group,which were exposed to air,intermittent hypoxia and continuing hypoxia respectively 8h/d for 35d.Then the blood and heart samples were collected,and the NF-kBp65 and MCP-1 levels in serum and in heart tissue were measured with ELISA and Western blot respectively. Results Compared to the control group the contents of NF-kBp65 and MCP-1 in serum and heart were increased both in intermittent hypoxia group and continuing hypoxia group. Conclusion NF-kBp65 and MCP-1 in heart and blood of intermittent hypoxia rats,which may be associated with the activation of NF-kB by hypoxia.