章正祥 曹克剛 范吉平

硝酸甘油型實驗性偏頭痛大鼠模型頸總動脈血流動力學(xué)初探

章正祥 曹克剛 范吉平

目的 觀察硝酸甘油（GTN）偏頭痛大鼠模型頸總動脈血流動力變化。 方法 采用皮下注射GTN法建立偏頭痛大鼠模型，應(yīng)用CBI脈沖多普勒血流計、BIOPAC多導(dǎo)生理信號記錄儀對空白組、生理鹽水組、硝酸甘油組血壓穩(wěn)定10min后連續(xù)6h監(jiān)測血流動力變化，運(yùn)用NOTOCORD－Hem 3.5系統(tǒng)提取1、2、3、4、5、6h等時間點(diǎn)的血流速度、心率、收縮壓、舒張壓、平均動脈壓。結(jié)果 GTN皮下注射后1h及2h血流速度分別降低（-8.35±3.41）cm/s和（-7.84±3.90）cm/s，而1、2、4h硝酸甘油組血流速度變化率與生理鹽水組和空白組相比均下降（P＜0.05）。GTN sc后收縮壓變化率、舒張壓變化率、平均動脈壓變化率在1、2、4h三個時間點(diǎn)與生理鹽水組和空白組相比均降低（均P＜0.05）。 結(jié)論 GTN致偏頭痛模型大鼠頸總動脈血流速度持續(xù)下降，為進(jìn)一步研究該模型提供實驗依據(jù)。

硝酸甘油 血流動力學(xué) 偏頭痛

Glyceryl trinitrate Hemodynamics Migraine

硝酸甘油（GTN）型偏頭痛大鼠模型由Cristina Tassorelli在1995年正式提出,是在體研究偏頭痛的主要動物模型之一。一氧化氮（NO）導(dǎo)致的血管擴(kuò)張及其后繼效應(yīng)是GTN型偏頭痛大鼠模型的主要造模原理，伴隨著血流變化是否也具有持續(xù)性，目前尚不明確。本研究采用Tassorelli法[1]復(fù)制實驗性偏頭痛大鼠模型，通過連續(xù)6h監(jiān)測觀察皮下注射硝酸甘油后的頸總動脈（CCA）血流動力變化，為進(jìn)一步運(yùn)用該模型提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動物 正常SPF級SD雄性大鼠24只，體重270～320g，來自北京維通利華動物實驗技術(shù)公司，許可證號為SCXK（京）2007-0001。

1.2 藥物 0.9%氯化鈉注射液（生理鹽水），北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號0705092W。硝酸甘油注射液，規(guī)格：5mg/ml，北京益民藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號20061105。戊巴比妥鈉，批號：020919，北京化學(xué)試劑公司，德國進(jìn)口分裝。

1.3 儀器 300-100型CBI脈沖多普勒血流計，由Triton技術(shù)有限公司生產(chǎn)；脈沖多普勒血流探頭（套囊直徑

1.0mm，型號E，頻率20MHz），美國Iowa多普勒公司提供；多導(dǎo)生理信號記錄儀由美國BIOPAC公司提供；分析軟件由美國NOTOCORD公司提供的NOTOCORD-hem 3.5系統(tǒng)，許可證號為8768-000595。智能恒溫控制儀、JR-1直流恒溫加熱毯，由成都泰盟科技有限公司生產(chǎn)。

1.4 方法

1.4.1 麻醉和總體準(zhǔn)備 實驗方案經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部重點(diǎn)實驗室批準(zhǔn)，并在該實驗室進(jìn)行，遵守動物福利保護(hù)。初始劑量用1%戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射，維持劑量每隔1h用1/5初始劑量腹腔注射。麻醉深度保持一致，以針刺激不能引出傷害性運(yùn)動反射或體循環(huán)血壓變化為度。

1.4.2 動物分組 將24只SD大鼠完全隨機(jī)分成硝酸甘油組、生理鹽水組、空白組。每組8只，連續(xù)6h監(jiān)測血壓、心率、血流速度。

1.4.3 手術(shù)方法 大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺（鼠板）上，頸部、左下腹部剪毛備皮。加熱毯置于大鼠背下，同時白熾燈泡（220伏，40瓦）照射頸部以維持體溫。分離氣管，用眼科鑷分離出右側(cè)頸總動脈（RCCA），結(jié)扎其遠(yuǎn)心端，22G動靜脈留置針?biāo)芰咸坠懿迦隦CCA近心端并通過連接血壓換能器連續(xù)監(jiān)測血壓，保證RCCA平均動脈壓在90mmHg以上；將心電的導(dǎo)聯(lián)電極和大鼠的皮下相連，用標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)測量心電各項指標(biāo)。脈沖多普勒血流探頭包含左頸總動脈（LCCA）并與之垂直，保證位置基本一致，通過與其相連的脈沖多普勒血流計連續(xù)監(jiān)測血流速度。動物一般切開氣管，16G動靜脈留置針套管插管，但是保持自主呼吸，避免長時間麻醉影響血流和血壓。

1.4.4 實驗過程 各組實驗交叉進(jìn)行，保證組間均衡，給藥與觀察者為同一人。待血壓、血流速度、心率穩(wěn)定10min后，皮下注射硝酸甘油（10mg/kg）[1]。生理鹽水組手術(shù)操作過程同上，皮下注射0.9%氯化鈉溶液（0.2ml/ 100g）?？瞻捉M手術(shù)操作同上，從血流穩(wěn)定10min開始計時。運(yùn)用NOTOCORD-Hem 3.5系統(tǒng)提取0、1、2、3、4、5、6h等時間點(diǎn)的血流速度、心率、平均動脈壓。皮下注射后即刻人為規(guī)定0時。

1.5 數(shù)據(jù)分析 采用血流速度變化率、心率變化率進(jìn)行評估。血流速度的變化率=（[各時間點(diǎn)血流值-基線值）/基線值×100%]；心率變化率=（[各時間點(diǎn)心率-基線值）/基線值×100%]；收縮壓變化率=（[各時間點(diǎn)收縮壓-基線值）/基線值×100%]、舒張壓變化率=（[各時間點(diǎn)舒張壓-基線值）/基線值×100%]、平均動脈壓變化率=（[各時間點(diǎn)舒張壓-基線值）/基線值×100%]。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件，正態(tài)計量資料用表示，偏態(tài)資料取對數(shù)、倒數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，計數(shù)資料用頻數(shù)來表示，同一時間點(diǎn)組間樣本均數(shù)比較采用ANOVA方差分析，多重比較采用SNK法；若數(shù)據(jù)為偏態(tài)或方差不齊，多組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗，兩組間比較采用Mann-Whitney Test雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 基線情況 各組大鼠體重、血流速度、心率、收縮壓、舒張壓、平均動脈壓在未干預(yù)前組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05），見表1。

表1 SD雄性大鼠血流動力學(xué)基線概況

2.2 血流動力學(xué)分析

2.2.1 硝酸甘油對SD雄性大鼠頸總動脈血流速度的影響 GTN注射后1、2、4h血流速度變化值分別為（-8.35± 3.41）、（-7.84±3.90）、（-7.04±4.53）cm/s，血流速度變化率與生理鹽水組和空白組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）（見圖1）。

圖1 硝酸甘油對頸總動脈血流速度變化率的影響（與空白組比較，*P＜0.05；與生理鹽水組比較，△P＜0.05）

2.2.2 硝酸甘油對SD雄性大鼠心率的影響 不同時間點(diǎn)各組心率兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05），不同時間點(diǎn)各組心率變化率兩兩比較均無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05），詳見表2。

2.2.3 硝酸甘油對SD大鼠頸總動脈血壓的影響 皮下注射硝酸甘油后1、2、4h，收縮壓變化值分別為（-55.30± 21.03）、（-59.83±16.03）、（-48.59±18.61）mmHg（P＜0.05）；舒張壓變化值分別為（-44.94±20.27）、（-47.43±17.81）、（-36.90±19.76）mmHg（P＜0.05）；平均動脈壓變化值分別為（-49.98±21.50）、（-53.73±17.45）、（-42.31±19.67）mmHg（P＜0.05）。GTN導(dǎo)致的收縮壓變化率、舒張壓變化率、平均動脈壓變化率變化趨勢類似，均在1、2、4h等時間點(diǎn)與生理鹽水組和空白組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），詳見表2。

3 討論

偏頭痛是具有遺傳性的復(fù)發(fā)性疼痛綜合征，發(fā)病率高，遷延難愈，嚴(yán)重影響著人類的生存質(zhì)量。5-羥色胺、降鈣基因相關(guān)肽，一氧化氮等物質(zhì)的深入研究有力的促進(jìn)了偏頭痛的病理生理機(jī)制發(fā)展。NO是一個調(diào)節(jié)顱內(nèi)外腦血流量和動脈直徑的重要分子，它參與疼痛的傷害性處理，NO的前體藥物GTN可誘發(fā)偏頭痛患者遲發(fā)性頭痛發(fā)作，且這種頭痛可被NOS抑制劑[2]L-NMMA,提示硝酸甘油誘發(fā)的頭痛發(fā)作與NO密切相關(guān)。

本文采用Tassorelli法[1]復(fù)制實驗性偏頭痛大鼠模型，動態(tài)的描述了硝酸甘油的頸總動脈外周血流動力學(xué)時間變化進(jìn)程。在皮下注射硝酸甘油后1、2、4h三個時間點(diǎn)，血流速度變化率、收縮壓變化率、舒張壓變化率、平均動脈壓變化率均下降，5h回到基線水平，但心率變化率在整個6h中無明顯變化。從本實驗可以看出，大鼠外周血流的變化有一定的時相性，與血壓的變化相一致。

皮層擴(kuò)散抑制（CSD）學(xué)說是偏頭痛先兆的主要發(fā)病機(jī)制。在CSD前行的同時伴隨血流降低區(qū)域向前方擴(kuò)大，到達(dá)感覺區(qū)出現(xiàn)感覺異常，即我們所說的先兆，包括視覺先兆等。GTN誘發(fā)的血流速度下降可能與偏頭痛的一些神經(jīng)缺損癥狀有關(guān)。10mg/kg的GTN使麻醉大鼠血壓發(fā)生劇烈變化，1、2、4h的收縮壓變化率變化值分別為（-0.363±0.1321）、（-0.3941±0.0987）、（-0.3201±0.1233）；舒張壓變化率變化值分別為（-0.3636±0.1642）、（-0.3838± 0.1449）、(-0.2999±0.1651)；平均動脈壓變化率變化值分別為（-0.3659±0.1555）、（-0.3944±0.1269）、（-0.3113± 0.1485），GTN使血壓下降1/3左右，且持續(xù)3h，這對實驗對象是一個巨大的傷害，盡管它成功的導(dǎo)致三叉神經(jīng)脊束尾側(cè)亞核（TNC）c-fos的表達(dá)。近來有些學(xué)者主張對GTN模型進(jìn)行完善，認(rèn)為麻醉和低血壓影響了c-fos的表達(dá)，應(yīng)使用臨床劑量的GTN建立清醒狀態(tài)的偏頭痛大鼠模型[3]。

目前在GTN模型研究中一般采用造模后1、2、4h等三個時間點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)上述時間點(diǎn)有遲發(fā)性炎癥和iNOS表達(dá)及外周的痛覺增敏效應(yīng)。本研究從血流動力學(xué)角度證實了GTN使血流速度、收縮壓、舒張壓、平均動脈壓在這三個時間點(diǎn)發(fā)生明顯變化，兩者之間是否存在對應(yīng)，具有時相的一致性，有待于進(jìn)一步研究。

[1]Tassorelli C,Joseph S A.Systemic nitroglycerin induces Fos immunoreactivity in brainstem and forebrain structures of the rat[J]. Brain Res,1995,682(1-2):167-181.

[2]Olesen J.The role of nitric oxide (NO)in migraine,tension-type headache and cluster headache[J].Pharmacol Ther,2008,120 (2):157-171.

[3]Ramachandran R,Bhatt D K,Ploug K B,et al.A naturalistic glyceryl trinitrate infusion migraine model in the rat[J].Cephalalgia,2012,32(1):73-84.

2012-01-11）

（本文編輯：沈昱平）

國家自然科學(xué)基金資助項目（30600828）

310006 杭州，浙江省中醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（章正祥）；北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（曹克剛）；中國中醫(yī)科學(xué)院（范吉平）

曹克剛，E-mail:kgdoctor@sina.com

【 Abstract】 ObjectiveTo study hemodynamic changes of common carotid artery in migraine rat model induced by glyceryl trinitrate (GTN). Methods Migraine rat model was established with GTN (10mg/kg,sc).Hemodynamic changes of blank group，normal saline group and GTN group after stable blood pressure for 10 minutes were monitored continuously by CBI pulsed Doppler flowmeter and BIOPAC multiplying channel physiological signal recorder for 6 hours,blood flow velocity,heart rate,systolic blood pressure,diastolic blood pressure and mean arterial pressure were extracted at 1,2,3,4,5,6 hours with NOTOCORDHem 3.5 soft system.Results Blood flow velocity descended(-8.35±3.41)cm/s and(-7.84±3.90)cm/s after 1h and 2h of GTN sc,At 1h,2h,4h blood flow velocity change rate had decreased compared with normal saline group and blank group (P＜0.05). Systolic blood pressure change Rate,diastolic blood pressure change rate and mean arterial blood pressure change rate in GTN group were lower more than normal saline group and blank group in the three time points of 1h,2h,4h(P＜0.05). Conclusion Blood flow velocity of common carotid artery has continued to decline induced by GTN for the further study of migraine rat model provides experimental evidence.