張 萍, 高云華, 劉 平, 劉 政, 譚開(kāi)彬

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超聲輻照載紫杉醇微泡對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞凋亡的影響

張 萍1, 高云華2*, 劉 平2, 劉 政2, 譚開(kāi)彬2

（1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院超聲科, 重慶 400010;2第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院超聲科, 重慶 400037）

探討超聲輻照載紫杉醇微泡對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）凋亡的影響及其作用機(jī)制。將體外培養(yǎng)的大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs用血小板衍生生長(zhǎng)因子-BB刺激后分組如下：對(duì)照組（A組）、超聲輻照+微泡組（B組）、超聲輻照+載紫杉醇微泡組（C組）、單純載紫杉醇微泡組（D組）和紫杉醇組（E組）。采用頻率1MHz、聲強(qiáng)0.3W/cm2的連續(xù)波超聲輻照VSMCs 120s，用流式細(xì)胞儀、Annexin V/PI染色和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡以及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。與A組比較，各組S期細(xì)胞比例均顯著降低（＜0.01），B組G0/G1期細(xì)胞比例顯著增高（＜0.01），D組和E組G2/M細(xì)胞比例顯著增高（＜0.01），C組G0/G1期細(xì)胞比例和G2/M細(xì)胞比例均顯著增高（＜0.01）。與A組比較，B組和C組VSMCs凋亡率顯著增高（＜0.01），Bax蛋白表達(dá)顯著上調(diào)、而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)則顯著降低（＜0.01）。超聲輻照載紫杉醇微泡可誘導(dǎo)VSMCs凋亡，其機(jī)制可能是微泡介導(dǎo)的超聲空化效應(yīng)，致Bax蛋白表達(dá)上調(diào)及Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)。

超聲; 載紫杉醇微泡; 肌細(xì)胞, 平滑肌; 凋亡

血管再狹窄（restenosis，RS）是影響經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入（percutaneous coronary intervention， PCI）治療后遠(yuǎn)期療效的主要問(wèn)題。血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的過(guò)度增殖和PCI術(shù)后早期VSMCs凋亡相對(duì)不足是RS發(fā)生的主要機(jī)制。目前臨床上采用的RS防治方法，包括血管內(nèi)放射治療和藥物涂層支架等均不能完全解決這一難題。近年來(lái)，有關(guān)將超聲靶向擊破微泡技術(shù)引入超聲治療的研究進(jìn)展十分迅速，利用微泡超聲造影劑為載體攜帶藥物，并借助超聲空化的能量在靶區(qū)擊破微泡，實(shí)現(xiàn)藥物在局部的釋放和滲透，提高局部藥物濃度，達(dá)到靶向治療的目的，將為臨床防治RS開(kāi)辟一種新型、無(wú)創(chuàng)、可重復(fù)的超聲治療方法[1]。本研究在前期實(shí)驗(yàn)制備的載紫杉醇脂質(zhì)微泡（paclitaxel-loaded liposome microbubbles，PLM）基礎(chǔ)上，就超聲輻照PLM對(duì)VSMCs凋亡的影響及機(jī)制進(jìn)行初步研究，為超聲輻照載藥微泡防治血管RS的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院超聲科實(shí)驗(yàn)室原代培養(yǎng)并傳代的大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs（第3～6代）。超聲造影劑：（1）脂氟顯由實(shí)驗(yàn)室自制，為包裹全氟丙烷氣體的脂質(zhì)微泡；（2）PLM按照文獻(xiàn)[2]的方法制備，包封率為（95.00%±1.22%），載藥量為（5.60%±0.11%），Co60滅菌處理后待用。血小板衍生生長(zhǎng)因子-BB（platelet derived growth factor-BB，PDGF-BB；Sigma公司）；紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品（成都福德瑞化工廠）；兔抗小鼠Bax單克隆抗體、兔抗小鼠Bcl-2單克隆抗體、免疫組化SP試劑盒（北京中山生物技術(shù)有限公司）。FACS calibur型流式細(xì)胞儀（美國(guó)Becton Dickinson公司）；AnnexinV-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒（北京寶賽生物技術(shù)有限公司）；超聲治療儀（TS-A型，北京天使科技有限公司）：頻率1MHz，功率范圍0～2.2W/cm2，超聲探頭面積10cm2，分為連續(xù)波和脈沖波發(fā)射方式。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的VSMCs無(wú)血清培養(yǎng)24h，用20μg/L PDGF-BB處理后，隨機(jī)分為以下5組，每組6個(gè)樣本。（1）對(duì)照組（A組）；（2）超聲+脂質(zhì)微泡組（B組）；（3）超聲+PLM組（C組）；（4）PLM組（D組）；（5）紫杉醇組（E組）。微泡濃度為1.0×109/L，C，D，E組中紫杉醇的濃度為10nmol/L。

1.3 超聲輻照

將VSMCs以1×108/L接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)板置于37℃水浴中，將治療頭固定距離培養(yǎng)板底部3mm處，功率設(shè)定為0.3W/cm2，連續(xù)波發(fā)射方式，輻照時(shí)間120s。其中A，D和E組進(jìn)行超聲假輻照。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)VSMCs細(xì)胞周期

各組VSMCs經(jīng)處理后繼續(xù)培養(yǎng)24h，然后進(jìn)行細(xì)胞消化、離心，加入預(yù)冷95%乙醇（終濃度為70%），冰浴30min后離心，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為（108～109）/L，加入碘化丙啶，室溫下避光染色30min，用流式細(xì)胞儀分析不同增殖周期細(xì)胞所占比例。

1.5 AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡

各組VSMCs經(jīng)處理后繼續(xù)培養(yǎng)24h，用0.25%胰蛋白酶消化制成1×108/L細(xì)胞懸液，離心后將細(xì)胞重懸于200μl結(jié)合緩沖液中，加入10μl AnnexinV-FITC和5μl碘化丙啶，避光室溫反應(yīng)15min，加入300μl結(jié)合緩沖液，用流式細(xì)胞儀以激發(fā)波長(zhǎng)488nm進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)VSMCs中Bax和Bcl-2的表達(dá)

將處理好的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定30min，用0.3% TritonX-100處理10min后，按SP免疫組化試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，抗Bax抗體和Bcl-2抗體的工作濃度均為1∶100。DAB顯色后，蘇木素復(fù)染，光鏡下觀察，并用Image pro plus 4.5圖像分析軟件進(jìn)行定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組VSMCs細(xì)胞周期分布比較

與A組比較，其余各組VSMCs的S期細(xì)胞比例均顯著降低（＜0.01），B組G0/G1期細(xì)胞比例顯著增高（＜0.01），D組和E組G2/M細(xì)胞比例顯著增高（＜0.01），C組G0/G1期細(xì)胞比例和G2/M細(xì)胞比例均顯著增高（＜0.01；表1）。

2.2 各組VSMCs凋亡率比較

B組和C組VSMCs凋亡率均顯著高于A組（＜0.01），但B組和C組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）；D組和E組細(xì)胞凋亡率與A組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05；表2）。

表1 流式細(xì)胞儀分析各組VSMCs的細(xì)胞周期分布

VSMCs: 血管平滑肌細(xì)胞; A組: 對(duì)照組; B組: 超聲+脂質(zhì)微泡組; C組: 超聲+載紫杉醇脂質(zhì)微泡組; D組: 載紫杉醇脂質(zhì)微泡組; E組: 紫杉醇組。與A組比較,**＜0.01

表2 各組VSMCs凋亡率及Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的比較

VSMCs: 血管平滑肌細(xì)胞; A組: 對(duì)照組; B組: 超聲+脂質(zhì)微泡組; C組: 超聲+載紫杉醇脂質(zhì)微泡組; D組: 載紫杉醇脂質(zhì)微泡組; E組: 紫杉醇組。與A組比較,**＜0.01

2.3 各組VSMCs中Bax和Bcl-2的表達(dá)

各組細(xì)胞Bax表達(dá)比較，B組和C組顯著高于A組（＜0.01）；但B組和C組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）；D組和E組與A組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。各組細(xì)胞Bcl-2表達(dá)比較，B組和C組顯著低于A組（＜0.01）；但B組和C組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）；D組和E組與A組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05；表2）。

3 討 論

目前PCI術(shù)后RS防治的研究熱點(diǎn)集中于局部治療，主要針對(duì)血管損傷后過(guò)度修復(fù)所致的新生內(nèi)膜增生。近年來(lái)多采用植入抗腫瘤藥物洗脫支架（drug eluting stent，DES），顯著降低了RS的發(fā)生率，但并未完全解決RS的問(wèn)題。首先，DES的遠(yuǎn)期療效有待證實(shí)，有報(bào)道DES植入術(shù)后出現(xiàn)遲發(fā)性支架內(nèi)RS，探究其原因，可能是支架植入后引起持續(xù)存在的、程度較重的炎癥反應(yīng)，在藥物釋放完、抑制增殖作用消失后，促使內(nèi)膜持續(xù)增生所致[3,4]；此外，對(duì)于不適宜行支架植入術(shù)的病變血管，如何有效防治RS的發(fā)生也是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。因此，尋找一種簡(jiǎn)便、安全、有效、持久的抑制新生內(nèi)膜增生的方法就成為防治PCI術(shù)后RS的焦點(diǎn)。

超聲造影劑藥物傳遞系統(tǒng)作為一種新型、無(wú)創(chuàng)、高效、簡(jiǎn)便易普及的靶向藥物傳輸技術(shù)是當(dāng)今超聲治療學(xué)的重要進(jìn)展，其優(yōu)勢(shì)在于：（1）可保持各種治療性物質(zhì)的活性和穩(wěn)定性，避免它們?cè)谘貉h(huán)中被破壞和降解；（2）由于超聲造影劑對(duì)超聲波敏感的特點(diǎn)，在靶區(qū)給予超聲輻照，可達(dá)到靶向給藥的目的，增加局部的治療效果并減少用藥劑量；（3）實(shí)時(shí)的超聲造影圖像能夠幫助監(jiān)控釋藥、治療過(guò)程，驗(yàn)證藥物的活性[5,6]。將超聲造影劑藥物傳遞系統(tǒng)運(yùn)用于RS局部防治的研究正處于初步探索階段，Kipshidze等[7]報(bào)道以全氟丁烷微泡超聲造影劑作為雷帕霉素的載體，將其注入豬冠狀動(dòng)脈支架植入模型的體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，治療組支架植入段的血管組織有高濃度的雷帕霉素，而且p27蛋白表達(dá)顯著高于手術(shù)組，組織形態(tài)學(xué)分析顯示治療組支架植入段血管內(nèi)膜增生面積較手術(shù)組減少40%，提示超聲造影劑藥物傳遞系統(tǒng)在防治PCI術(shù)后的RS中有潛在的應(yīng)用前景。

紫杉醇是一種有絲分裂抑制劑，能促進(jìn)微管聚合并抑制其解聚，從而形成大量非正常聚合的微管，使紡綞體失去正常功能，抑制細(xì)胞有絲分裂，最終細(xì)胞停滯在G2/M期。文獻(xiàn)報(bào)道，紫杉醇能誘導(dǎo)多種癌細(xì)胞的凋亡，最初認(rèn)為紫杉醇對(duì)微管系統(tǒng)的作用和將細(xì)胞阻滯于G2/M期是其誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)紫杉醇誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是多途徑、多種方式的復(fù)雜過(guò)程，細(xì)胞周期的阻斷并不直接誘導(dǎo)凋亡[8,9]。此外，不同種類(lèi)細(xì)胞、同一種細(xì)胞來(lái)源不同種屬或不同環(huán)境下的細(xì)胞對(duì)紫杉醇反應(yīng)性不同，其原因可能與細(xì)胞內(nèi)在的基因狀態(tài)如p53、Bcl-2基因家族、c-myc等的表達(dá)水平有關(guān)，也與細(xì)胞所處的環(huán)境如激素、細(xì)胞因子等水平有關(guān)，并且其誘導(dǎo)凋亡的作用具有濃度依賴(lài)性[10]。研究表明，紫杉醇可對(duì)VSMCs的遷移和增殖有抑制作用，從而抑制新生內(nèi)膜的增生，可用于介入治療后RS的防治，這種效應(yīng)所需的紫杉醇血藥濃度在納摩爾水平，大約是抗腫瘤效應(yīng)所需的血藥濃度的百分之一至千分之一[11]。

我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，一定能量的超聲聯(lián)合脂質(zhì)微泡不僅可抑制PDGF-BB所致的VSMCs增殖，還可誘導(dǎo)VSMCs凋亡，并證實(shí)微泡介導(dǎo)的超聲空化效應(yīng)是其主要作用機(jī)制[12]。此外，超聲輻照載紫杉醇微泡對(duì)VSMCs增殖的抑制作用明顯強(qiáng)于單用紫杉醇或超聲輻照空白微泡，提示超聲輻照下載紫杉醇微泡的破裂不僅通過(guò)可以產(chǎn)生的空化效應(yīng)來(lái)抑制VSMCs增殖，而且由于空化效應(yīng)本身可導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加，促使微泡釋放出來(lái)的紫杉醇更多地進(jìn)入VSMCs內(nèi)發(fā)揮作用。本研究在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，觀察超聲輻照PLM對(duì)處于增殖狀態(tài)的VSMCs凋亡的影響。結(jié)果顯示，超聲輻照PLM和超聲輻照空白微泡均可顯著增加于VSMCs的凋亡率，而且兩組細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而僅用含相同紫杉醇濃度的PLM或紫杉醇溶液作用于VSMCs而不施以超聲輻照，雖然G2/M期的細(xì)胞比例顯著增高，但細(xì)胞凋亡率無(wú)顯著變化。說(shuō)明PLM和紫杉醇雖然能將VSMCs阻滯在G2/M期，但并不能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其原因可能是紫杉醇濃度較低，不足以致細(xì)胞凋亡。由此可見(jiàn)，超聲輻照PLM誘導(dǎo)VSMCs凋亡的作用主要是通過(guò)微泡介導(dǎo)的超聲空化實(shí)現(xiàn)的。

細(xì)胞凋亡是一個(gè)可調(diào)節(jié)的動(dòng)態(tài)過(guò)程，受一系列凋亡相關(guān)基因的調(diào)控，其中Bcl-2和Bax是一對(duì)正負(fù)凋亡調(diào)節(jié)基因。Bcl-2表達(dá)上調(diào)可特異性抑制細(xì)胞凋亡，細(xì)胞存在的周期并不影響其作用的發(fā)揮；而B(niǎo)ax過(guò)度表達(dá)則能促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡，故Bax/Bcl-2的比值決定細(xì)胞是否凋亡。我們的研究發(fā)現(xiàn)，超聲輻照PLM和超聲輻照空白脂質(zhì)微泡均可使VSMCs的Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)和Bax蛋白表達(dá)上調(diào)，Bax/Bcl-2比值增高，提示微泡介導(dǎo)的超聲空化效應(yīng)可能通過(guò)有效增高Bax/Bcl-2比值這一途徑來(lái)誘導(dǎo)VSMCs凋亡。

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（編輯: 胡曉暉）

Effect of paclitaxel-loaded microbubbles triggered with ultrasound irradiation on apoptosis of rat vascular smooth muscle cells

ZHANG Ping1, GAO Yun-Hua2*, LIU Ping2, LIU Zheng2, TAN Kai-Bin2

(1Department of Ultrasonography, Second Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400010, China;2Department of Ultrasonography, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037, China)

To investigate the effect of paclitaxel-loaded microbubbles (PLM) triggered with ultrasound irradiation on the apoptosis of rat vascular smooth muscle cells (VSMCs) and its mechanism.Rat thoracic aortic VSMCs were treated by platelet derived growth factor-BB, and then randomly divided into five groups as follows: control group (group A), microbubbles combined with ultrasound irradiation group (group B), PLM combined with ultrasound irradiation group (group C), PLM treated group (group D), and paclitaxel treated group (group E). VSMCs from groups B and C were exposed to 1 MHz continuous wave ultrasound for 120s at intensity of 0.3W/cm2. The cell cycle, apoptoitc cells and the expression of Bax and Bcl-2 were detected by flow cytometry, AnnexinV/PI staining and immunocytochemical assay, respectively.Compared with group A, the number of the cells arrested at S phase was decreased significantly in other groups (＜0.01). The percentage of the cells at G0/G1phase was greatly increased in group B, that of G2/M phase cells was increased remarkably in group D and E (＜0.01), and those of G0/G1phase cells and G2/M phase cells were increased significantly in group C (＜0.01). Apoptosis rate was significantly higher in group B and C than in group A (＜0.01), while the expression of Bax was increased, and that of Bcl-2 decreased (＜0.01).Ultrasound triggered PLM induces rat VSMCs apoptosis, which might be due to upregulation of Bax and downregulation of Bcl-2 induced by microbubbles-mediated ultrasound cavitation.

ultrasound; paclitaxel-loaded microbubbles; vascular smooth muscle cells; apoptosis; rat

(06MA185)(KJ110320).

R543

A

10.3724/SP.J.1264.2013.00113

2012-12-10;

2012-12-30

全軍醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金（06MA185）;重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（KJ110320）

高云華, Tel: 023-68755114, E-mail: xqgaoyh@yahoo.com.cn