李金博,李詩剛,徐義炎,吳燕民

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所,北京100081； 2.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院,甘肅 蘭州 730020； 3.深圳市鐵漢生態(tài)環(huán)境股份有限公司，深圳 518040)

白三葉(Trifoliumrepens)，又稱為白車軸草、白花苜蓿、荷蘭翹搖，是豆科(Leguminosae)三葉草屬的多年生匍匐型草本植物。按葉型分為大葉、中葉和小葉3種類型[1]。原產(chǎn)歐洲和小亞細(xì)亞，16世紀(jì)在荷蘭栽培種植，17世紀(jì)后傳入英國，隨后傳入新西蘭、美國等[2]。目前白三葉在世界上分布很廣，除南極洲外，各大洲均有分布。其中，在新西蘭、澳大利亞、丹麥、美國、荷蘭、俄羅斯等國栽培面積較大。而新西蘭、丹麥、美國3個國家也供應(yīng)了世界上55%以上的白三葉種子[3]。白三葉在我國大體分布于22°-51° N，80°-130° E地區(qū)，主要在四川、云南、貴州等省。在浙江、江蘇、湖南、湖北、廣西、福建、河北以及新疆、遼寧、吉林等省均有野生種，貴州除羅甸、榕江、銅仁、赤水等17個“高溫縣”未發(fā)現(xiàn)白三葉外，其它66個縣(市)均有野生種[4]。近年來，筆者在廣東、甘肅、河南也發(fā)現(xiàn)有白三葉的大面積分布。白三葉具有莖葉豐富、草質(zhì)細(xì)軟、營養(yǎng)價值高、適口性好、產(chǎn)量高的特點，是優(yōu)良的豆科牧草。同時，由于白三葉具有適應(yīng)性強、抗逆性強、耐踐踏、恢復(fù)快、侵占性強、顏色碧綠均勻、花葉俱美、綠期長的優(yōu)良特性，使其成為城市綠化、美化山川的優(yōu)良草種，也是綴花草坪、庭院草坪、街道草坪、廠區(qū)草坪較為理想的觀花觀葉冷季型草坪草[5-6]。隨著我國城市綠化和生態(tài)修復(fù)的發(fā)展，白三葉在園林綠化上應(yīng)用越來越多，建坪面積曾一度占到了我國北方景觀草坪面積的15%左右[7-8]。白三葉的廣泛應(yīng)用也推動了對其越來越深入的研究。

目前，全世界栽培的白三葉品種有300個以上[9]，選育品種最多的國家為丹麥、新西蘭、澳大利亞和荷蘭。國外從20世紀(jì)20年代初就開始進行白三葉育種的研究，荷蘭首先育出白三葉品種Dutch。進入40年代后，荷蘭、美國等先后育出Tammninges、Kenland等數(shù)10個白三葉和紅三葉草品種。新西蘭最早種植的草地胡依阿(Grasslands Huia)一度占據(jù)全世界白三葉種子市場的35%～40%[2]。目前,澳大利亞的海法(Haifa)、美國的拉迪(丁)諾(Ladino)、丹麥的郎代科(Klondike)等品種也逐漸開始在市場上占據(jù)較大份額。

我國對白三葉育種工作研究較少，主要集中在引種和適應(yīng)性栽培、品種比較方面。自1993年以來，為了篩選適于四川地區(qū)的白三葉品種材料，育種家們成功從美國白三葉品種拉丁諾中選育出川引拉丁諾，可以在海拔200～3 500 m栽培，并從不同白三葉品種間初步篩選出適于四川建坪用的草種，發(fā)掘出了具有四葉或五葉的變異復(fù)葉型的優(yōu)良新材料寶興白三葉以及葉面具有美麗斑紋的白三葉材料[10-11]。而夏先玖[12]對百綠集團的4個白三葉品種進行試驗觀察，認(rèn)為Sustain和C6151白三葉再生好、產(chǎn)量高，越夏率超過80%，在四川盆地值得推廣。云貴地區(qū)是我國重要的白三葉種植區(qū)，種植面積大，分布范圍廣，引種時間長，云南分布較廣的國外引進的“拉丁諾”、“草地休衣”、“海法”3個品種中，海法抗旱、抗熱、耐瘠薄能力強，適應(yīng)云南大部分地區(qū)，草地休衣適合在南溫帶地區(qū)栽培，拉丁諾在降雨較多地區(qū)宜做刈割草地品種[13-14]。2013年何靜等[15]引種了62份俄羅斯白三葉在貴州南部進行適應(yīng)性觀察和篩選評價，選出兩種產(chǎn)量高、抗性強，適合在貴州南部種植利用的白三葉，并選出3種抗旱性好、植株侵占性強、可作為草坪型品種推廣的白三葉材料。長江中下游地區(qū)也是白三葉重要生長地區(qū)，研究者歷時十年從美國瑞加和路易斯安那白三葉品種中選育出抗旱耐熱性較好的白三葉品種鄂牧一號[16]，并于2009年從俄羅斯的6個野生白三葉材料中篩選出2、5、6號適合在長江中下游推廣應(yīng)用的白三葉品種[17]，為下一步選育優(yōu)良品種奠定了基礎(chǔ)。我國白三葉品種較少，選育還處在起步階段，與國外相比還有相當(dāng)大的差距。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，白三葉在轉(zhuǎn)基因、逆境生理及遺傳多樣性等方面的研究也得到了極大的發(fā)展，為其應(yīng)用和發(fā)展提供了新的材料及研究方向。

1 白三葉再生體系的建立

1.1經(jīng)過愈傷組織階段再生途徑 白三葉的離體胚、根、葉柄、下胚軸等多種外植體在組織培養(yǎng)條件下都可經(jīng)過愈傷組織階段。自1980年Gresshoff[19]懸浮培養(yǎng)白三葉成熟胚，利用原生質(zhì)體誘導(dǎo)愈傷組織形成完整植株以來，白三葉莖尖和白三葉葉片外植體成為了研究人員的試驗方向，并成功形成愈傷組織，得到完整植株[20-21]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，基因型及外植體類型不同，其形成愈傷組織及完整植株的能力顯著不同[22]。1982年Bhojwani等[23]以白三葉葉肉原生質(zhì)體為外植體得到了愈傷組織及植株。其后，研究者以白三葉幼苗切段、莖尖、莖段等外植體也都分別獲得了愈傷組織及完整植株[24-26]。而1989年Yamada[27]選擇出一種能高度再生原生質(zhì)體的白三葉基因型。

我國開展白三葉研究較晚。自1992年，安利佳和李鳳霞[28]研究了白三葉的愈傷組織的誘導(dǎo)和植株的再生的方法和技術(shù)以來，研究人員分別利用白三葉葉片和未成熟胚誘導(dǎo)愈傷組織，并獲得胚性細(xì)胞懸浮系[29-31]。

1.2外植體直接再生途徑 外植體在NAA和BAP的培養(yǎng)基上都很容易培養(yǎng)生長，并且其再生性能在多種基因型白三葉上得到驗證，同時外植體直接再生8～9周即可定植，相比愈傷組織培養(yǎng)6～9個月極大縮短了培養(yǎng)時間，并避免了體細(xì)胞克隆異常的問題。研究人員認(rèn)為，子葉葉柄部是較好的快速再生的外植體來源，萌發(fā)3 d的子葉直接再生出植株，轉(zhuǎn)化率為1%。而用吸漲種子的子葉器官再生生出植株，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到50%[32-33]。

我國在20世紀(jì)90年代后開始相關(guān)方面的研究。白三葉莖尖細(xì)胞分化能力最強，子葉分化能力較低，胚軸下部幾乎不分化[34-35]。周建明從白三葉成熟胚上成功誘導(dǎo)白三葉不定芽的生長后，又成功利用白三葉子葉培養(yǎng)出再生植株[36]，為后來研究者的工作奠定了基礎(chǔ)。

2 白三葉轉(zhuǎn)基因研究

自從1987年White和Grenwood[37]首次用含有雙元載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化白三葉品種WR8匍匐莖并成功獲得轉(zhuǎn)化體以來，白三葉轉(zhuǎn)基因研究得到迅速發(fā)展，目前主要集中在抗病蟲[38-47]、抗逆[48-57]、磷的吸收利用[58-61]、品質(zhì)改良[62-69]等方面(表1)。

2.1抗病蟲 白三葉生長過程中容易受到苜?；ㄈ~病毒(AMV)、白三葉花葉病毒(WCMV)、三葉草黃脈病毒(CYVV)等病毒病的危害，并在生產(chǎn)上造成極大的損失[39]。針對WCMV病毒編碼一個復(fù)制酶、三個肌動蛋白和一個外殼蛋白的結(jié)構(gòu)，科研工作者開發(fā)出相應(yīng)的免疫病毒轉(zhuǎn)基因序列[40]。研究發(fā)現(xiàn)，WCMV外殼蛋白(WCMV-CP)的積累可以降低病毒的擴展速度，推遲病毒的發(fā)生[41-42]。近些年來，Ludlow等[43-44]利用來源于復(fù)制酶的RNAi處理白三葉獲得了高效表達(dá)抗病性的轉(zhuǎn)基因植株。而AMV的防治也取得了一定進展，AMV病毒編碼MP和CP復(fù)制酶，但僅有AMV-CP才有表達(dá)效果。利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將外源AMV-CP轉(zhuǎn)入白三葉子葉中，得到具有抗卡拉霉素轉(zhuǎn)基因再生植株，經(jīng)過檢測證明外源目的基因已經(jīng)整合到白三葉基因組中并得到了表達(dá)，并具有較好的抗性表現(xiàn)[45-46]。

鱗翅類昆蟲對白三葉的生長會造成嚴(yán)重危害。目前，一系列蛋白酶抑制劑(PIs)、凝集素、淀粉酶抑制劑、內(nèi)霉素等抗蟲基因得到了廣泛的應(yīng)用。Voisey等[47]將BtCryBa和PIs基因轉(zhuǎn)入白三葉，研究發(fā)現(xiàn)BPT1表達(dá)水平較低，能夠減緩幼蟲的生長，CryBa得到中等水平的表達(dá)，抑制了幼蟲的進食并可縮短其壽命。

表1 白三葉轉(zhuǎn)基因研究進展Table 1 Transgenic research of white clover

2.2抗逆 培育具有滲透脅迫抗性、耐鋁性強的白三葉是育種的重要目標(biāo)。白三葉可以通過根尖有機酸的合成來抑制其對鋁離子的吸收，增強對鋁毒害的抗性。白三葉有機酸合成關(guān)鍵酶主要有檸檬酸酶(CS)、蘋果酸酶(neMDH)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PC)[48]等。將細(xì)菌的檸檬酸合成酶基因轉(zhuǎn)入白三葉后，能夠促使白三葉根部分泌更多的檸檬酸，抑制白三葉根尖對鋁離子的吸收，提高白三葉的耐鋁性，顯著提高其對酸性環(huán)境的適應(yīng)性，在較高濃度的鋁離子濃度條件下轉(zhuǎn)基因植株仍然正常生長[49]。通過轉(zhuǎn)基因研究控制有機酸合成酶關(guān)鍵基因CaMV35S啟動子、TrPT1的作用，發(fā)現(xiàn)根的生長和葉片生物量在鋁脅迫下比對照明顯加快或增多[50-52]，進一步說明白三葉有機酸可以有效增強其抗鋁能力。

植物抗旱耐鹽堿研究已取得了長足的進步，科技人員克隆出一系列相關(guān)基因，并獲得了大量的抗旱耐鹽植物，而白三葉相對發(fā)展較晚，取得成果較少。轉(zhuǎn)錄因子WXP1和P5CS基因均能較好地提高植物抗旱性，研究人員將這兩個基因成功導(dǎo)入白三葉中，經(jīng)過對比，轉(zhuǎn)基因植株比對照抗旱生理指標(biāo)均有一定程度的提高[53-54]。為了提高白三葉的耐鹽性，在克隆研究了各種具有一定耐鹽效果的基因后，陳傳芳等[55]、趙志文等[56]通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別將山菠菜(Prunellaasiatica)甜菜堿醛脫氫酶(BADH)、反義磷脂酶基因PLDγ轉(zhuǎn)入白三葉受體，分子檢測說明已經(jīng)成功獲得轉(zhuǎn)基因植株，并證明了轉(zhuǎn)基因植株的細(xì)胞膜在鹽脅迫下受到了保護，具有一定的耐鹽性。而從擬南芥(Arabidopsisthaliana)液泡膜的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因AtNHX1轉(zhuǎn)入白三葉胡依阿，轉(zhuǎn)基因植株對鹽脅迫的耐受性顯著提高，植株總?cè)~面積和地上部分干質(zhì)量更是顯著大于對照[57]。

2.3土壤中磷的利用 磷素在土壤中易被吸附固定，導(dǎo)致植物吸收利用磷元素的能力急劇下降。研究發(fā)現(xiàn)，在磷缺乏條件下，植物分泌的植酸酶顯著增加，研究人員將植酸酶的表達(dá)作為轉(zhuǎn)基因育種的一個重要目標(biāo)[58]。Ma等[59]利用農(nóng)桿菌接種將植酸酶基因MtPHY1和酸性磷酸酶基因轉(zhuǎn)入白三葉，比對照非轉(zhuǎn)基因植株生物量顯著增加，磷含量也有大幅度提高。為了獲得具有較高磷吸收效率的白三葉植株，韓勝芳等[60]、谷俊濤等[61]分別利用子葉下胚軸為外植體，通過農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化途徑，建立了高效表達(dá)黑曲霉PhyA基因和異源表達(dá)白羽扇豆(Lupinusalbus)酸性磷酸酶APase基因的白三葉草轉(zhuǎn)基因系，高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因系植株的磷素累積量、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量顯著增加，證明外源轉(zhuǎn)化PhyA基因和APase基因均能顯著增強白三葉利用有機態(tài)磷的能力。

2.4品質(zhì)改良 白三葉體內(nèi)蛋白質(zhì)，特別是甲硫氨酸和半胱氨酸等含硫氨基酸可以顯著增加羊的生產(chǎn)量和羊毛的生產(chǎn)量[62-64]。豌豆清蛋白基因能夠有效增加白三葉蛋白質(zhì)含量，并且增加葉片的壽命[65-66]。而編碼蛋白基因在不同啟動子作用下可以有效積累編碼蛋白，在研究了3種啟動子Assu、Lssu、CAMV35S后發(fā)現(xiàn)，Assu啟動子作用下SSA蛋白積累最高，可以提高葉蛋白含量的0.1%[67]。而轉(zhuǎn)富硫玉米(Zeamays)儲存蛋白基因也能明顯改善白三葉的飼用價值[68]。另外,Lepage等[69]利用農(nóng)桿菌將果聚糖轉(zhuǎn)移酶基因SacB轉(zhuǎn)化白三葉，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株莖中可溶性碳水化合物積累增加。

3 白三葉遺傳多樣性分析

種質(zhì)資源遺傳多樣性研究是品種改良和育種的基礎(chǔ)，世界各國紛紛開展了相關(guān)方面的研究[70-80](表2)。

3.1形態(tài)學(xué)水平多樣性分析 形態(tài)標(biāo)記是植物遺傳多樣性分析的重要方面。Widdcup等[70]從美國東部收集了98個白三葉集群并與美國的拉迪諾，新西蘭的5個品種共同栽植，通過比較材料間葉片大小、綠期、越夏性等生理生態(tài)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)美國白三葉材料在新西蘭表現(xiàn)大多不如新西蘭本地品種，但也有幾個表現(xiàn)性狀較好的材料，可以通過與當(dāng)?shù)仄贩N回交雜交進行改良，形成新的優(yōu)良品種[70]。為了進一步搜集選育優(yōu)良的白三葉品種，Dzene等[71]對從19個國家收集的46份白三葉材料分析比較越冬性、花期、葉質(zhì)量、花序小花數(shù)等形態(tài)生理性狀，選出‘Dubraux’、‘Gigant’ 、‘Huia’ (New Zealand) 和‘Ecotype 2005’共4份材料，具有高產(chǎn)、早熟等優(yōu)良性狀。近年來我國也通過對白三葉形態(tài)標(biāo)記的研究和分類，在白三葉基礎(chǔ)研究上得到了較快發(fā)展。為了探尋各地白三葉遺傳變異情況，研究者對喀斯特地區(qū)不同年齡草地白三葉葉數(shù)、生長點數(shù)、中葉長、中葉長寬比等性狀進行比較發(fā)現(xiàn)，葉質(zhì)量、莖質(zhì)量、根質(zhì)量、地上生物量等指標(biāo)的種群內(nèi)變異系數(shù)則隨著草地年限的增加而增大[72]。新疆地區(qū)分布有白三葉，研究者收集了13份白三葉材料并對株高、葉形、葉色、花色等性狀進行了遺傳多樣性分析，將其劃分為3類，為以后的研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)[73]。王建麗等[74]和李州等[75]對所收集的白三葉材料主要數(shù)量性狀的變異和相關(guān)性進行分析，發(fā)現(xiàn)種質(zhì)材料存在著豐富的遺傳多樣性，各個數(shù)量性狀間均呈正相關(guān)，能為各類白三葉育種和遺傳研究提供較為豐富的親本材料[74-75]。

3.2分子水平遺傳多樣性分析 隨著生物技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記也在遺傳多樣性分析中發(fā)揮出越來越重要的作用。Kolliker等[76]利用AFLP對52份白三葉材料進行遺傳多樣性分析，品種相似系數(shù)從0.42到0.92。在此基礎(chǔ)上為了探究SSR在白三葉遺傳多樣性分析中的作用，Jahufer等[77]利用39對SSR引物對32份白三葉材料遺傳多態(tài)性分析，將其聚類到14個群組，平均相似系數(shù)為0.56，聚類結(jié)果與已知的基因型關(guān)系分析相似，說明SSR標(biāo)記可以有效對白三葉進行遺傳多樣性分析。利用AFLP和RAPD技術(shù)，Badr等[81]也對一些白三葉材料構(gòu)建了指紋圖譜，揭示了其親緣關(guān)系，并對其遺傳進化關(guān)系進行了一定推測。我國分子標(biāo)記技術(shù)發(fā)展較晚，但也探究建立了穩(wěn)定可靠的白三葉RAPD技術(shù)體系，為白三葉遺傳多樣性RADP分析奠定基礎(chǔ)[79]，并利用形態(tài)學(xué)性狀遺傳多樣性分析和等位酶分析遺傳多樣性對多份白三葉材料進行比較，發(fā)現(xiàn)兩種方法聚類分析結(jié)果不完全一致。但從總體來看，它們都可以從不同的側(cè)面來反映白三葉的遺傳多樣性，而且其結(jié)果也基本一致[80]。張婧源等[78]對來自五大洲的41份白三葉材料通過優(yōu)化后的SRAP進行遺傳多樣性分析，證明白三葉種質(zhì)材料有豐富的遺傳多態(tài)性，且能將來自于同一地方的白三葉聚類，可靠性較高。

表2 白三葉遺傳多樣性研究Table 2 Genetic diversity research of white clover

4 白三葉逆境生理研究

4.1干旱 白三葉根系較淺，對水分比較敏感，容易遭受干旱脅迫，因此，研究其抗旱性差異及抗旱生理對其廣泛應(yīng)用具有重要意義。干旱脅迫時，植物膜結(jié)構(gòu)受到破壞、脯氨酸在植物體內(nèi)積累、葉綠素合成減少[82-85]。利用盆栽白三葉進行土壤干旱處理，發(fā)現(xiàn)白三葉葉片細(xì)胞質(zhì)膜相對透性提高，體內(nèi)游離脯氨酸急劇積累，葉綠素急速分解，超氧化物歧化酶活性呈現(xiàn)先升后降的趨勢[86]。在此基礎(chǔ)上，進一步對白三葉植株葉、莖、根等器官及其生長部位的細(xì)胞質(zhì)膜通透性、丙二醛、游離脯氨酸含量、可溶性蛋白質(zhì)含量及SOD活性比較研究發(fā)現(xiàn)，抗逆性物質(zhì)積累根大于莖，莖大于葉，葉是植株中對干旱脅迫最敏感的部位，可作為抗旱脅迫的檢測位點?？购蛋兹~品種通過增加可溶性糖、脯氨酸含量提高滲透勢及增加深根數(shù)量的能力顯著大于抗旱性差的品種[87-88]。生理形態(tài)指標(biāo)的變化在抗旱品種選擇中起了重要作用，朱旺生[89]通過研究干旱脅迫對不同白三葉品種幼苗形態(tài)、生長和生理指標(biāo)的影響，認(rèn)為白三葉品種百霸抗旱性能顯著好于考拉和鋪地。

4.2溫度 在我國北方，白三葉容易受低溫影響，冬季萎黃干枯比其他草坪草[早熟禾(Poaspp.)、高羊茅(Festucaarundinacea)等]早，來年返青卻又相對較晚，且返青均勻度差，影響了白三葉的開發(fā)利用，因此，人們不斷探究白三葉的抗寒機理，以期選出具有較好抗寒性的品種。研究發(fā)現(xiàn),白三葉匍匐莖頂端和腋芽組織耐凍性比較強，匍匐莖的生活力決定于頂芽、腋芽和維管束等特定器官的生機能力[90]。而溫度降低時，白三葉各項生理指標(biāo)也具有顯著變化，丙二醛含量逐漸上升，電導(dǎo)率升高，而SOD和POD活性表現(xiàn)出先降低后上升再下降的趨勢[91-92]。植物本身生理結(jié)構(gòu)也極大影響其抗寒性，研究發(fā)現(xiàn)抗寒性強的白三葉品種，柵欄細(xì)胞葉綠體面積大，而韌皮部比率和導(dǎo)管直徑小[93]。這些研究為選育新的抗寒性強的品種提供了較好的理論和實踐依據(jù)。

隨著我國畜牧業(yè)的發(fā)展，白三葉在南方也得到了大面積的使用推廣，但白三葉是優(yōu)良的冷季型草坪草，其最適合的生長溫度是19～24 ℃，冬季低溫在-15 ℃，具有較高越冬率，高溫條件下出現(xiàn)大面積枯萎減緩甚至停止生長，貴州地區(qū)旬氣溫超過27 ℃，極端氣溫超過37 ℃的地區(qū)均未發(fā)現(xiàn)白三葉[94]，探究白三葉耐熱機理，選育抗高溫白三葉成為近些年的研究熱點之一。人工模擬高溫發(fā)現(xiàn)，45 ℃是白三葉葉片在高溫脅迫下大量喪失水分的拐點，也是大量喪失水分的臨界溫度，同時也是細(xì)胞膜通透性變化的臨界溫度；在對白三葉體內(nèi)脯氨酸含量、葉綠素降解程度研究后發(fā)現(xiàn)，35 ℃屬于白三葉正常生長范圍，而40～45 ℃是白三葉忍耐高溫的臨界溫度，50 ℃則是白三葉的致死溫度[95]。白三葉種子發(fā)芽受溫度影響極大，在40 ℃脅迫下種子不發(fā)芽；在20～35 ℃內(nèi)處理種子可以縮短種子萌發(fā)所需的時間，但白三葉種子發(fā)芽率隨溫度升高而降低，通過變溫處理能夠顯著提高白三葉種子的發(fā)芽率[96]。張鶴山等[97]也比較了18種三葉草的耐熱性，為長江流域及以南方區(qū)域推薦了海法、克勞等耐熱性較強的白三葉品種。

4.3重金屬 在經(jīng)濟發(fā)展的同時，其所帶來的重金屬污染日漸成為世界性的難題并帶來嚴(yán)重的環(huán)境和健康的風(fēng)險[98]。在眾多土壤修復(fù)方法中，植物修復(fù)相比其他物理化學(xué)方法來說具有成本低廉、無污染，對場地環(huán)境擾動少等優(yōu)點[99]。在研究中發(fā)現(xiàn)白三葉是一種重要的重金屬土壤修復(fù)植物。白三葉生物量大、植株地上部分對銅吸收總量較高，對銅具有較強耐性，是良好的修復(fù)銅污染土壤的植物[100]。白三葉不僅僅對銅具有富集作用，當(dāng)鎘質(zhì)量濃度低于25 mg·L-1時,三葉草對不同質(zhì)量濃度鎘的轉(zhuǎn)運系數(shù)基本接近1或大于1，表現(xiàn)出富集植物的特性[101]。同時，白三葉也對芘污染土壤具有較好的富集作用，在對比試驗中，白三葉比對照富集芘率高20%～46%，具有良好的修復(fù)能力[102]。白三葉具有良好的土壤修復(fù)功能，在多種重金屬積累的土壤上，隨重金屬濃度的增加，吸收的重金屬總量隨之增加，但其對重金屬吸收具有一定的拮抗作用[103]，在利用中應(yīng)加以注意。

5 存在的問題、對策與展望

近年來白三葉在我國得到了廣泛的應(yīng)用和發(fā)展，但相比新西蘭、澳大利亞等國家,我國對白三葉的研究嚴(yán)重滯后，主要存在以下幾個問題：1)全世界已經(jīng)選育出白三葉品種300多個，而我國白三葉選育品種很少。因此，應(yīng)該加強白三葉選育力量，建立快速選育體系，提高品種選育速度，選育出我國自己的品種。2)我國在綠化和牧草種植上需要的大量白三葉種子主要依靠進口，目前國內(nèi)還未有規(guī)?；陌兹~種子生產(chǎn)基地。需要進一步探究我國白三葉種子生產(chǎn)的技術(shù)體系及生產(chǎn)制度，建立具有良好經(jīng)濟效益和社會效益的種子生產(chǎn)基地。3)我國幅員遼闊，地理條件復(fù)雜，白三葉在各地表現(xiàn)狀況不盡相同，各生態(tài)型白三葉品種缺少分類標(biāo)準(zhǔn)，針對性較差。應(yīng)當(dāng)收集我國各地的白三葉種質(zhì)資源并對其進行遺傳多樣性分析，選擇適合當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)類型的白三葉品種，指導(dǎo)當(dāng)?shù)氐陌兹~生產(chǎn)應(yīng)用。4)遺傳轉(zhuǎn)化體系目前較為單一，轉(zhuǎn)化效率不高，而實用性高的目的基因較少。未來應(yīng)深入探討白三葉遺傳轉(zhuǎn)化體系影響因素，完善遺傳轉(zhuǎn)化體系，加強具有高表達(dá)量目的基因的篩選，為實用性、商業(yè)化轉(zhuǎn)基因白三葉的發(fā)展奠定基礎(chǔ)[104]。

白三葉是優(yōu)質(zhì)豆科牧草，也是良好的地被植物，具有重要的生物學(xué)意義和社會經(jīng)濟效益。在已有的白三葉研究基礎(chǔ)上，應(yīng)繼續(xù)加強對白三葉育種、生理和轉(zhuǎn)基因等方面的研究。因此，針對我國白三葉生產(chǎn)和科研的實際情況，應(yīng)加強抗逆性強、營養(yǎng)豐富、生物量高的白三葉牧草的選育，同時隨著園林綠化的發(fā)展，具有特色、外形美觀的地被草坪白三葉也將是白三葉選育的重要方向?，F(xiàn)代生物技術(shù)的興起為培育和改良植物品種提供了一條便捷和實用的途徑，利用傳統(tǒng)育種與現(xiàn)代生物技術(shù)相結(jié)合，通過多基因聚合育種、同效多基因育種和基因工程技術(shù)[105]，以期獲得具有較高蛋白質(zhì)含量、抗高熱、耐鹽堿、抗病蟲、觀賞性強的白三葉新品種。使得白三葉得到進一步的發(fā)展和更加廣泛的應(yīng)用，創(chuàng)造更大的經(jīng)濟和社會價值。

[1] Toshihiko Y,紀(jì)亞君．放牧密度對多年生黑麥草-白三葉草地上白三葉品種的影響[J]．青海草業(yè),2001(4):44-45.

[2] 胡迪生,封超壁,朱邦長.白三葉營養(yǎng)動態(tài)研究[J].草業(yè)學(xué)報,1994(5):44-50.

[3] Mather R D J,Melbuish D T,Herlihy M.Trends in the global marketing of white clover cultivars[J].Agronomy Society of New Zealand Special Publication,1996，11:7-14.

[4] 貴州野生白三葉草資源調(diào)查組.貴州野生白三葉草資源調(diào)查總結(jié)[R].貴州,1981.

[5] 張飛龍,楊燕梅.白三葉的特性及栽培要點[J].云南農(nóng)業(yè),2005(11):7.

[6] 宋滿珍.優(yōu)美的觀賞性地被植物——白花三葉草[J].園林綠化,2001(11):43.

[7] 孫吉雄.草坪學(xué)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2002:52-531.

[8] 胡中華,劉師漢.草坪與地被植物[M].北京:中國林業(yè)出版社,1998:112-131.

[9] 張英俊.白三葉種子生產(chǎn)與管理[M].昆明:云南科學(xué)技術(shù)出版社,2006:23.

[10] 毛凱,蘭興平.不同白三葉品種間草坪性狀的比較分析[J].草業(yè)科學(xué),1993,10(5):40-44.

[11] 張新全,蒲朝龍,周壽榮,等.川引拉丁諾白三葉品種選育及栽培利用[J].中國草地,1999(2):34-37.

[12] 夏先玖.白三葉和黑麥草品種在成都地區(qū)的引種試驗[J].草業(yè)科學(xué),2003,20(12):12-14.

[13] 鐘聲,奎嘉祥.三個白三葉品種在云南的生長表現(xiàn)[J].中國草地,1999(4):21-24.

[14] 匡崇義,薛世明,奎嘉祥,等.不同氣候帶的白三葉品比試驗研究[J].四川草原,2004(11):16-19.

[15] 何靜,陳瑞祥,劉秀峰.俄羅斯白三葉在貴州南部的引種試驗初報[J].種子,2013,32(3):59-61.

[16] 鮑健寅,李維俊,馮蕊華,等.抗旱耐熱白三葉新品種選育初報[J].草地學(xué)報,1997,6(1):15-19.

[17] 吳海濤,劉大林,馬晶晶,等.6種野生白三葉的適應(yīng)性與營養(yǎng)特性研究[J].四川畜牧獸醫(yī),2009(5):26-27.

[18] 趙桂琴,王鎖民,任繼周.白三葉轉(zhuǎn)基因及其生態(tài)適應(yīng)性研究進展[J].生態(tài)學(xué)報.2004,24(3):592-598.

[19] Gresshoff P M.In vitro culture of white clover:Callus,suspension,protoplast culture and plant regeneration[J].Botanical Gazette,1980,141(2):157-164.

[20] Cheyne V E A,Dale P J.Shoot tip culture in forage legumes[J].Plant Science Letters,1980，19:303-309.

[21] Dos Santos A V P,Davey M R.Origin and development of somatic embryos inMedicagosativaL.(alfalfa)[J].Protoplasma,1983，109:227-234.

[22] Mohapatra S S,Gresshoff P M.Ecotypic variation of in vitro plantlet formation in white clover (Trifoliumrepens) [J].Plant Cell Reports,1982，5:189-192.

[23] Bhojwani S S,White D W R.Mesophyll protoplasts of white clover:Isolation,culture and organogenesis [J].Plant Science Letters,1982,26(2):265-271.

[24] Parrot W A,Collins G B.Callus and shoot-tip culture of eightTrifoliumspecies in vitro with regeneration via somatic embryogenesis ofT.rubens[J].Plant Science Letters,1982(28):189-194.

[25] Grant J E.Plant regeneration from cotyledonary tissue ofGlycinecanescens,a perennial wild relative of soybean[J].Plant Cell Tissue Organ Culture,1984,3(2):169-173.

[26] White D W R,Greenwood D.Transformation of the forage legumeTrifoliumrepensL.using binary Agrobacterium vectors[J].Plant Molecular Biology,1987,8(6):461-469.

[27] Yamada T.Selection of a highly oregenerative genotype of white clover(TrifoliumrepensL.)and plant regeneration from proto-plasts derived from this genotype[J].Euphytica,1989,44(3):181-186.

[28] 安利佳,李鳳霞.豆科植物組織培養(yǎng)的研究[J].植物學(xué)報,1992,34(10):743-752.

[29] 張德炎,李建民,李喜文,等.紅三葉和白三葉愈傷組織的誘導(dǎo)和胚性細(xì)胞懸浮系的建立[J].中國草地,1999(1):15-18.

[30] 張德炎,李喜文,李建民,等.正交設(shè)計法在白三葉組織培養(yǎng)中的應(yīng)用[J].東北師大學(xué)報(自然科學(xué)版),1998(1):40-45.

[31] 周建明.以農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)為載體向白三葉(TrifoliumrepensL.)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)外源基因的研究[J].草食家畜,1996(1):44-45.

[32] White D W R,Voisey C.Agrobacterium-mediated transformation of white clover using direct shoot organogenesis[J].Plant Cell Reports,1994,13(6):303-308.

[33] Larkin P J,Gibson J M,Mathesius U,etal.Transgenic white clover studies with the auxin-responsive promoter-GH3,in root gravitropism and lateral root development[J].Transgenic Research,1996，5:325-335.

[34] 楊麗莉,賈煒瓏,張彥芹.白三葉高頻率植株再生系統(tǒng)的研究[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué),2002,30(3):70-72.

[35] 楊麗莉,賈煒瓏,張彥芹.影響白三葉高頻率植株再生因素的研究[J].華北農(nóng)學(xué)報,2003,18(4):66-68.

[36] 周建明.從白三葉(TrifoliumrepensL.)成熟的胚再生不定芽的初步研究[J].草食家畜,1995(1):52-53.

[37] White D W R,Grenwood D.Transformation of the forage legumeTrifoliumrepensL.using binary agrobacterium vectors[J].Plant Molecular Biology,1987,8(6):461-469.

[38] Gibson P B,Barnett O W,Skipper H D,etal.Effects of 3 viruses on growth of white clover[J].Plant Disease,1981,65(1):50-51.

[39] Forster R L S,Bevan M W,Harbison S A,etal.The complete nucleotide sequence of the potexvirus White clover mosaic virus[J].Nucleic Acids Research,1988,16(1):291-303.

[40] Hackland A F,Rybicki E P,Thomson J A.Coat protein-mediated resistance in transgenic plants[J].Archives of Virology,1994，139:1-22.

[41] Voisey C R,Dudas B,Biggs R ,etal.Development and implementation of molecular markers for forage crop improvement[J].Molecular Breeding of Forage Crops,2001，10:239-250.

[42] 趙桂琴,Chu P.用農(nóng)桿菌介導(dǎo)將WCMV基因?qū)氚兹~的研究[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2004,25(增刊Ⅱ):1-4.

[43] Ludlow E J.RNA silencing as a new tool for antiviral defence and functional genomics in white clover[D].Melbouren:La Trobe University,2006.

[44] Ludlow E,Mouradov A,Spangenberg G.Generation of transgenic white clover (TrifoliumrepensL.) plants resistant to white clover mosaicvirus[A].Proceedings of the Fifth International Symposium on the Molecular Breeding of Forage and Turf[C].Sapporo:the Fifth International Symposium on the Molecular Breeding of Forage and Turf,2007:104

[45] Ding Y L,Aldao-Humble G,Ludlow E,etal.Efficient plant regeneration andAgrobacterium-mediated transformation inMedicagoandTrifoliumspecies[J].Plant Science,2003,165:1419-1427.

[46] 趙桂琴,慕平,Chu P.苜蓿花葉病毒外殼蛋白基因在白三葉中的表達(dá)及轉(zhuǎn)基因植株的抗病性分析[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報,2005,13(2):230-234.

[47] Voisey C R,White D W R,Dudas B,etal.Agrobacterium-mediated transformation of white clover using direct shoot organo-genesis[J].Plant Cell Reports,1994,13:309-314.

[48] Aidyn Z Mouradov.Designer pasture plants:From single cells to the field[J].PNAS,2010,65:205-211.

[49] Spangenberg G,Kalla R,Lidgett A.Transgenesis and genomics in molecular breeding of forage plants[A]. Proceedings of the 10th Australian Agronomy Conference[C].Hobart:the 10th Australian Agronomy Conference,2001.

[50] Labandera M.Development and evaluation of transgenic white clover(Trifoliumrepens) for enhanced aluminium tolerance and phosphorus acquisition efficiency[D].Melbourne:La Trobe University,2007.

[51] Labandera C M,Lin YH,Ludlow E,etal.Discovery,isolation and Character-isation of Promoters in White Clover (TrifoliumrepensL.)[C].Wageningen:Wageningen,2005.

[52] Labandera M,Panter S,WinkworthA,etal.Transgenic white clover (TrifoliumrepensL.) Plants with Modified Organic Acid Metabolism for Aluminium Tolerance and Phosphorus Acquisition Efficiency[C].New York:Springer,2007:102.

[53] Jiang Q Z,Zhang J Y,Guo X L,etal.Improvement of drought tolerance in white clover (Trifoliumrepens) by transgenic expres-sion of a transcription factor geneWXP1[J].Functional Plant Biology,2010,37:157-165 .

[54] 李志亮,楊清,葉嘉,等.利用P5CS基因轉(zhuǎn)化白三葉的研究[J].生物技術(shù)通報,2012(5):61-65.

[55] 陳傳芳,李義文,陳豫,等.通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得耐鹽轉(zhuǎn)甜菜堿醛脫氫酶基因白三葉草[J].遺傳學(xué)報,2004,31(1):97-101.

[56] 趙志文,趙強,崔德才.轉(zhuǎn)反義磷脂酶Dγ基因白三葉草的獲得[J].生物技術(shù)通報,2005(1):47-51.

[57] 趙桂琴,慕平,王鎖民,等.轉(zhuǎn)液胞膜AtNHX1基因的白三葉耐鹽性研究[J].農(nóng)業(yè)生物技學(xué)報,2008,16(5):847-852.

[58] Li M,Osaki M,Rao I M,etal.Secretion of phytase from the roots of several plant species under phosphorusdeficient conditions[J].Plant and Soil,1997,195:161-169.

[59] Ma X F,Wright E,Ge Y,etal.Improving phosphorus acquisition of white clover (TrifoliumrepensL.) by transgenic expression of plant-derived phytase and acid phosphatase genes[J].Plant Science,2009,176:479-488.

[60] 韓勝芳,谷俊濤,肖凱.高效表達(dá)黑曲霉PhyA基因改善白三葉草對有機態(tài)磷的利用[J].作物學(xué)報,2007,33(2):250-255.

[61] 谷俊濤,李金才,韓勝芳,等.異源表達(dá)白羽扇豆酸性磷酸酶基因?qū)Π兹~草磷吸收的影響[J].草業(yè)學(xué)報,2007,16(4):69-75.

[62] Wandelt C L,Khan M R I,Craig S,etal.Vicilin with carboxy-terminalKDELis retained in the endoplasmic reticulum and accumulates to high levels in the leaves of transgenic plants[J].The Plant Journal,1992,2(2):181-192.

[63] Bagga S,Sutton D,Kemp J D,etal.Constitutive expression of theβ-phaseolingene in different tissues of transgenic alfalfa does not ensure phaseolin accumulation in non-seed tissue[J].Plant Molecular Biology,1992,19(6):951-958.

[64] Tabe L M,Higgins C M,McNabb W C,etal.Genetic engineering of grain and pasture legumes for improved nutritive value[J].Genetica,1993(90):181-200.

[65] Ealing P M,Hancock K R,Derek D W.Expression of the pea albuminl gene in transgenic white clover and tobacco[J].Transgenic Research,1994,3(6):344-354.

[66] Khan M R I,Cerotti A,Ceriotti A,etal.Accumulation of a sulphur-rich seed albumin from sunflower in the leaves of transgenic subterranean clover (TrifoliumsubterraneumL.)[J].Transgenic Research,1996,5(3):179-185.

[67] Christionsen P,gibson J M,Moore A,etal.TransgenicTrifoliumrepenswith foliage accumulating the high sulphur protein,sunflower seed albumin[J].Transgenic Research,2000,9:103-113.

[68] Sharma S B,Hancook K R.Expression of a sulfur-rich maize seed storage protein,δ-zein,in white clover (shapeTrifoliumrepens) to improve forage quality[J].Molecular Breeding,1998(4):435-448.

[69] Lepage C,Mackin L,Ligdett A,etal.Development of transgenic white clover expressing chimeric bacterial levansucrase genes for enhanced tolerance to drought stress[A].Proceedings of the 2nd International Symposium Molecular Breeding of Forage Crops[C].London:The 2nd International Symposium Molecular Breeding of Forage Crops,2000:80-81.

[70] Widdcup K H,Caradus J R ,Green J,etal.White clover ecotype germplasm from the USA for development of New Zealand and overseas cultivars[J].Agronomy Society of New Zealand Special Publication,1998,11:149-153.

[71] Dzene A,Jansone J B,Rancane S.The study of variability of agro-morphological characteristics of white clover accession from other countries in Latvian climate conditions[J].Agronomy Research,2010,8:537-544.

[72] 李莉,王元素,洪紱曾.喀斯特地區(qū)白三葉形態(tài)和遺傳多樣性研究[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報,2010,19(7):1532-1536.

[73] 王玉祥,張博.新疆野生白三葉表型性狀變異研究[J].草地學(xué)報,2012,20(6):1163-1168.

[74] 王建麗,申忠寶,潘多鋒,等.白三葉種質(zhì)資源主要數(shù)量性狀的變異與相關(guān)性研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2012,28(26):19-23.

[75] 李州,彭燕,張婧源,等.白三葉種質(zhì)資源形態(tài)變異與地理起源的關(guān)系[J].草業(yè)科學(xué),2012,29(11):1706-1714.

[76] Kolliker R,Jones E S,Jahufer M A A,etal.Bulked AFLP analysis for the assessment of genetic diversity in white clover (TrifoliumrepensL.)[J].Euphytica,2001,121:305-315.

[77] Jahufer M Z Z,Barrett B A,Griffiths A G,etal.DNA fingerprinting and genetic relationships among white clover cultivars[J].Proceedings of the New Zealand Grassland Association,2003,65:163-169.

[78] 張婧源,彭燕,羅燕,等.不同產(chǎn)地白三葉種質(zhì)遺傳多樣性的SRAP分析[J].草業(yè)學(xué)報,2010,19(5):130-138.

[79] 張賢,張英俊,吳維群.白三葉RAPD分析條件優(yōu)化[J].草地學(xué)報,2006,14(3):219-222.

[80] 何俊.62份白三葉草種質(zhì)資源遺傳多樣性初步研究與評價[D].貴陽:貴州大學(xué),2008.

[81] Badr A,El-Shazly H H,Mekki L.Genetic diversity in white clover and its progenitors as revealed by DNA fingerprinting[J].Biologia Plantarum,2012,56(2):283-291.

[82] 李錦樹,王洪春,王文英,等.干旱對玉米葉片細(xì)胞透性及膜脂的影響[J].植物生理學(xué)報,1983(3):223-228.

[83] 湯章誠,王育啟,吳啟華,等.不同抗旱品種高粱苗中脯氨酸累積的差異[J].植物生理學(xué)報,1986,12(2):154-162.

[84] 谷瑞升,郗榮庭,童本群.早實核桃水分指標(biāo)的研究[J].林業(yè)科學(xué),1991(27):461-464.

[85] 夏陽.水分逆境對果樹脯氨酸和葉綠素含量變化的影響[J].花卉園藝,1993(10):60-65.

[86] 鮑健寅,楊特武,馮蕊華,等.高溫和干旱對白三葉生長發(fā)育及生理特性的影響[J].草業(yè)學(xué)報,1995(4):9-16.

[87] 楊特武,鮑健寅,何光明,等.干旱脅迫下白三葉器官生理特性變化及其SOD在抗旱中的作用[J].中國草地,1997(4):55-61.

[88] 韓建秋,張志國.水分脅迫對白三葉物質(zhì)分配和根系生長的影響[J].草業(yè)科學(xué),2007,24(11):32-36.

[89] 朱旺生.干旱脅迫對不同白三葉品種幼苗抗旱性的影響[J].草原與飼料,2010,30(6):30-35.

[90] 朱邦長.中國的白三葉草資源[J].中國草原與牧草,1986,3(1):4-9.

[91] 新發(fā)田修治,嶼田徹.白三葉匍匐莖的凍害[J].日本草地學(xué)會志，1982(4):19-22.

[92] 安瑩,陳雅君,趙偉,等.低溫對白三葉膜質(zhì)過氧化及保護酶活性的影響[J].草原與草坪,2009(3):8-10.

[93] 范玉貞.自然低溫脅迫對白三葉草的膜損傷與SOD活性的影響[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2010(2):405-409.

[94] 趙偉,陳雅君,高陽,等.白三葉品種組織結(jié)構(gòu)與抗寒性的關(guān)系[J].草地學(xué)報,2008(5):234-238.

[95] 何俊,何勝江,付強,等.人工模擬高溫環(huán)境下白三葉草相對生理指標(biāo)測定[J].貴州畜牧獸醫(yī),2007(3):1-3.

[96] 張鶴山,陳明新,田宏,等.高溫脅迫下白三葉種子萌發(fā)特性及耐熱性研究[J].種子,2010,29(8):1-5.

[97] 張鶴山,劉洋,王鳳,等.18個三葉草品種耐熱性綜合評價[J].草業(yè)科學(xué),2009,26(7):44-49.

[98] 肖鵬飛,李法云,付寶榮,等.土壤重金屬污染及其植物修復(fù)研究[J].遼寧大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2004,31(3):279-283.

[99] 周守標(biāo),李思亮.重金屬污染下植物生理生態(tài)反應(yīng)及富集機制的研究進展[J].安徽師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2007,30(3):331-337.

[100] 趙達(dá)偉.銅污染的超富集、富集植物篩選[D].西安:陜西師范大學(xué),2011.

[101] 劉燕,謝阿娜.三葉草對重金屬鎘的富集特性研究[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,40(1):82-84.

[102] Xu S Y,Chen Y X,lin K F,etal.Removal of pyrene from contaminated soils by white clover[J].Pedosphere,2009,19(2):265-272.

[103] 韓照祥,朱惠娟,李春峰.三葉草對土壤中銅和鉛的吸收及其相互影響研究[J].淮海工學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版),2006,15(1):48-51.

[104] 梁哲,馬江濤,吳燕民,等.三葉草基因工程研究進展[J].草業(yè)學(xué)報,2009,18(2):205-211.

[105] 馬江濤,王宗禮,黃東光,等.基因工程在牧草培育中的應(yīng)用[J].草業(yè)學(xué)報,2010,19(6):248-262.