馬 欣，董鳳麗，劉 杰，劉晨旭，周蘊(yùn)薇

(東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

菊花是我國的傳統(tǒng)名花，也是世界上重要的切花種類之一。地被菊(Chrysanthemumgrandiflorum)是菊科菊屬的多年生宿根草本花卉，是菊花中的一個品種群，具有植株低矮、耐粗放管理、花緊密、花期長等特點(diǎn)[1]。地被菊還具有較強(qiáng)的抗寒性和抗旱性，適合于露地栽植過冬等特點(diǎn)，因而越來越廣泛地應(yīng)用于城市綠化。目前，對于地被菊的組織培養(yǎng)和快速繁殖也有研究，如利用葉片[2]、莖段[3]、花瓣[4]、子房[5]等外植體建立再生體系和對試管苗的生根研究[6]。成功的基因轉(zhuǎn)化首先依賴于良好的植物受體系統(tǒng)的建立，其中外植體的選擇以及能產(chǎn)生高再生能力的培養(yǎng)體系的確立是轉(zhuǎn)化體系建立的關(guān)鍵[7]。但地被菊花品種繁多，而其再生受基因型的限制，再生體系沒有普遍性，有些品種再生不穩(wěn)定[8]，不同品種葉片的再生能力具有一定的差異，而且不同品種的胚性愈傷組織的誘導(dǎo)差別很大[9]。此外,由于后期基因的遺傳轉(zhuǎn)化多采用葉盤法[10]，所以，本研究以地被菊‘雪公主’葉片為材料，對外植體消毒，通過設(shè)置不同激素配比濃度，篩選出愈傷組織誘導(dǎo)、分化和繼代生根的最佳培養(yǎng)基，建立高效、穩(wěn)定的再生體系，期為基因工程提供良好的受體系統(tǒng)，以及為后期的基因遺傳轉(zhuǎn)化和細(xì)胞工程育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1供試材料 選擇東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院花卉研究所內(nèi)地被菊‘雪公主’的帶腋芽莖段為外植體。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1無菌材料的獲得 將采集的帶腋芽的莖段在洗衣粉水中漂洗5 min，用流水沖洗30～60 min，除去有損傷的部分。在超凈工作臺上用無菌水沖洗3次，用75%的酒精消毒30 min，無菌水洗3遍,用2%的NaClO分別浸泡滅菌4、5、6、7、8 min，無菌水徹底清洗3遍。用無菌濾紙吸干表面的水分，接種到MS培養(yǎng)基中。7 d左右統(tǒng)計污染率，20 d側(cè)芽長成1 cm左右。

1.2.2葉片愈傷組織的誘導(dǎo)和分化 選擇繼代20 d左右的嫩苗，將頂端第2-3片葉子除去葉緣，切成5 mm×5 mm的葉盤，隨后接種到在MS培養(yǎng)基附加不同濃度6-BA(1.0、1.5、2.0 mg·L-1)和NAA(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mg·L-1)的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織及芽分化，使其葉盤近軸面接觸培養(yǎng)基,每個處理6個重復(fù)。10 d后統(tǒng)計愈傷組織的誘導(dǎo)率，25 d后統(tǒng)計芽的分化率。

1.2.3莖段的增殖 選擇繼代20 d左右的嫩苗，切取長度約1.5 cm帶有兩個腋芽的嫩莖段，隨后接種到在MS培養(yǎng)基附加不同濃度6-BA(0、0.1、0.2、0.3、0.4 mg·L-1)和NAA(0、0.1、0.2、0.3、0.4 mg·L-1)的培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)莖段的增殖。每個三角瓶中接種兩棵莖段，每個處理10個重復(fù)，20 d后統(tǒng)計增殖系數(shù)。

1.2.4繼代生根 待不定芽生長至約1.5 cm時自基部剪下，接種至MS培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，每20 d左右繼代一次。生根培養(yǎng)時，將不定芽接種至分別添加NAA(0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg·L-1)的MS培養(yǎng)基和1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每處理3個重復(fù)，10 d后統(tǒng)計生根率和平均生根系數(shù)。

1.2.5煉苗移栽 將生根后的組培苗煉苗1 d后，取出并洗凈根部附著的培養(yǎng)基，移栽至經(jīng)過高壓滅菌的蛭石中，15 d后移栽到沙和土壤的混合壤土中，30 d后統(tǒng)計成活率。

1.3培養(yǎng)條件 培養(yǎng)基均以MS為基本培養(yǎng)，培養(yǎng)基含蔗糖30 mg·L-1、瓊脂8～9 g·L-1，培養(yǎng)基在高壓滅菌前將pH值調(diào)至5.8；1/2MS培養(yǎng)基中大量元素減半，pH值不變。培養(yǎng)溫度為(25±2) ℃，光照強(qiáng)度為2 000 lx，光照時間為12 h·d-1。

1.4評價指標(biāo)

污染率=(污染個數(shù)/接種個數(shù))×100%;

萌發(fā)率=(萌發(fā)個數(shù)/存活個數(shù))×100%;

誘導(dǎo)率=(形成愈傷組織的材料/接種個數(shù))×100%;

分化率=(再生不定芽的外植體數(shù)/接種個數(shù))×100%;

增殖系數(shù)=增殖后的幼苗數(shù)/接種的幼苗數(shù);

生根率=(生根的幼苗數(shù)/接種的幼苗數(shù))×100%;

平均生根數(shù)=根的總數(shù)/生根的幼苗數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1消毒時間對污染率的影響 外植體自身的生長狀況對于再生體系的建立有著重要的影響，所以外植體的消毒也是一個重要過程。本試驗(yàn)選用NaClO進(jìn)行消毒，不僅消毒效果明顯，還不必進(jìn)行廢液回收，相比于升汞更加簡便、環(huán)保。對消毒時間進(jìn)行對比表明，隨著消毒時間的增加，污染率降低，但是外植體受腐蝕情況嚴(yán)重，導(dǎo)致萌發(fā)率降低。消毒8 min時雖然污染率最低(5個)，但此時萌發(fā)率僅為52.6%(表1)。用2%的NaClO浸泡處理6 min時，污染率為25%，此時消毒效果最佳。

表1 外植體的消毒時間和污染率Table 1 Disinfection time and polluted rate of explants

2.2不同激素濃度的培養(yǎng)基對葉片分化的影響 再生苗的幼嫩葉片再生能力較強(qiáng)。選擇大小和營養(yǎng)長勢一致的葉片，接種7 d后，葉片在切口處長出嫩綠色的愈傷組織。20 d后，有的愈傷組織邊緣開始分化出綠色的芽點(diǎn)。試驗(yàn)表明，葉片基部的分化率高于其他部分。本試驗(yàn)采用菊花組織培養(yǎng)中最常用的植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA和NAA，所設(shè)定的培養(yǎng)基所培養(yǎng)愈傷的誘導(dǎo)率均達(dá)到100%。當(dāng)6-BA一定時，葉片的分化率隨著NAA濃度的變大而升高；達(dá)到一定高度時又出現(xiàn)抑制現(xiàn)象(表2)。當(dāng)6-BA和NAA的濃度分別為1.0和0.6 mg·L-1時，分化率達(dá)最高，即在培養(yǎng)基MS+1.0 mg·L-16-BA+0.6 mg·L-1NAA上，葉片的分化率最高，為63.6%。

2.3不同激素濃度對莖段增殖的影響 將繼代25 d左右的嫩苗自基部剪下，接種到附加不同濃度6-BA和NAA的MS培養(yǎng)基中，促進(jìn)叢生芽形成。25 d后，叢生芽的數(shù)量達(dá)最高，但隨著時間的增加，由于培養(yǎng)基營養(yǎng)的缺乏，叢生芽有萎蔫的趨勢。MS培養(yǎng)基不能促進(jìn)莖段的增殖，隨著6-BA和NAA濃度的升高，莖段的增殖系數(shù)也逐漸升高，但當(dāng)6-BA和NAA分別升至0.3和0.2 mg·L-1時達(dá)到最高值(表3)。因此，在培養(yǎng)基MS+0.3 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA上，莖段的增殖系數(shù)最高(6.73)，且叢生芽的生長狀態(tài)良好。

2.4不同培養(yǎng)基對繼代生根的影響 待叢生芽生長約1.5 cm時自基部剪下，接種至MS培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)。結(jié)果表明，MS培養(yǎng)基對于‘雪公主’不僅有較好的繼代效果，而且有良好的復(fù)壯作用。同瓶培養(yǎng)的苗數(shù)以兩棵為宜，過多則長勢受到明顯影響。同時，隨著繼代次數(shù)的增加，組培苗出現(xiàn)了長勢變?nèi)醯内厔?。雖然在MS培養(yǎng)基中，‘雪公主’也有明顯的生根現(xiàn)象，但是1/2 MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)的根數(shù)較多，生根率達(dá)100%，平均生根數(shù)為8條。在1/2 MS培養(yǎng)基中添加不同濃度的NAA時，其生根系數(shù)呈隨濃度增加而提高的趨勢。但當(dāng)NAA濃度高于0.5 mg·L-1時，生根系數(shù)下降，地上部分的生長勢也下降。所以，生根培養(yǎng)基選用1/2MS+0.5 mg·L-1NAA培養(yǎng)基(表4)。

2.5組培苗的馴化及移栽 在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)25 d后，選擇生長健壯的無菌苗，經(jīng)過1 d的煉苗后，取出，并洗凈根部附著的培養(yǎng)基，移栽至經(jīng)過滅菌的蛭石中。注意遮陰處理，通風(fēng)保濕，15 d后移栽到沙和土壤的混合壤土中。30 d后組培苗的成活率可達(dá)100%，而且生長良好(圖1)。

3 討論

在地被菊的組織培養(yǎng)研究中，不同的組織或器官都可以作為外植體，但是由帶腋芽的莖段獲得無菌苗更加簡便，而且比葉片受消毒的影響小，所以本研究選擇的外植體為帶腋芽的莖段。對于外植體的消毒，采用NaClO能達(dá)到良好的效果，相比于以往的試驗(yàn)中采用的升汞消毒法，不僅減少了對人體的毒害作用，也大大降低了環(huán)境污染[11]。雖然在以往地被菊的組織培養(yǎng)中生長調(diào)節(jié)物質(zhì)有多種，但受基因型影響，6-BA和NAA對‘雪公主’影響顯著，所以本研究采用這兩種激素進(jìn)行誘導(dǎo)，建立再生體系。由于葉盤法是菊花基因轉(zhuǎn)化的主要方法，而且轉(zhuǎn)化后的體細(xì)胞胚胎發(fā)生的再生植株遺傳穩(wěn)定性很強(qiáng)[12]，所以以葉片誘導(dǎo)叢生芽的研究比其他組織或器官有更加重要的意義。

表2 不同6-BA和NAA濃度對葉片分化的影響Table 2 Effects of different concentrations of 6-BA and NAA on the differentiation capability of leaf blades

表3 不同6-BA和NAA濃度對莖段增殖的影響Table 3 Effects of different concentrations of 6-BA and NAA on the proliferation of stem segments

表4 基本培養(yǎng)基和不同NAA濃度對叢生芽生根的影響Table 4 Effects of basal medium and different concentrations of NAA on rooting of adventions buds

圖1 地被菊再生體系幾個連續(xù)階段的培養(yǎng)情況Fig.1 Sequential phases of Chrysanthemum grandiflorum regeneration system

在地被菊的快速繁殖研究中，不僅不同品種的愈傷組織分化差別很大，而且同一品種同一器官的不同部分分化率也存在很大差別。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，葉片基部的分化能力大于其他部分，這與花瓣[13]的研究結(jié)果相似，原因可能是葉脈處的細(xì)胞更易于分化出不定芽。所以，對于葉片大小和營養(yǎng)長勢的選擇也應(yīng)盡量一致，試驗(yàn)中認(rèn)為具有20 d左右苗齡的無菌苗中上部幼嫩葉片基部的再生能力高，這與前人的研究相符[14]。

由于每次得到的無菌苗數(shù)量有限，不足以為后期的試驗(yàn)提供足夠的材料，所以通過繼代培養(yǎng)來擴(kuò)大無菌苗的數(shù)量也是必要的。試驗(yàn)中隨著繼代次數(shù)的增加，出現(xiàn)了組培苗長勢下降的現(xiàn)象，原因可能是組培苗經(jīng)過多次繼代培養(yǎng)后出現(xiàn)了遺傳不穩(wěn)定性。而且隨著同瓶培養(yǎng)的苗數(shù)的增加，組培苗的長勢明顯下降，說明瓶中空間對于組培苗的生長也有很大影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)同瓶培養(yǎng)的無菌苗數(shù)量以2～3株效果最佳。另外，做生根培養(yǎng)時，1/2MS培養(yǎng)基好于MS培養(yǎng)基，這與多數(shù)研究結(jié)果一致[15]。原因可能是礦質(zhì)元素濃度較低時有利于生根，較高時有利于發(fā)展莖葉，高濃度的無機(jī)鹽抑制了不定根的生長。

本研究以地被菊‘雪公主’為試驗(yàn)材料，通過設(shè)定不同濃度的6-BA和NAA建立再生體系，完成了快速繁殖的過程。由于地被菊花優(yōu)良品種種源較少，所以通過組織培養(yǎng)可迅速快繁。再生體系的建立不僅為后期的基因轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)，而且大大地提高了繁殖系數(shù), 使地被菊‘雪公主’的大規(guī)?？焖偕a(chǎn)成為可能。

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