凌云霄 江城 鄭娟等
摘要:選取麥芽糊精作為羰基供體,采用紅外處理誘發(fā)血漿蛋白粉與麥芽糊精發(fā)生美拉德反應(yīng),從而提高血漿蛋白粉凝膠特性。首先以血漿蛋白粉的溶解性、凝膠性以及色差為檢測指標(biāo),通過單因素試驗(yàn)研究了紅外處理時間、溫度以及麥芽糊精的添加量對血漿蛋白粉品質(zhì)的影響,在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,再采用響應(yīng)面法優(yōu)化血漿蛋白粉的加工工藝。結(jié)果表明:優(yōu)化試驗(yàn)的最佳條件為紅外溫度92℃,紅外時間17min,麥芽糊精添加量0.56%,測得其凝膠強(qiáng)度為175.52g/cm2,凝膠強(qiáng)度較對照組68.57g/cm2提高了1.56倍。
關(guān)鍵詞:血漿蛋白粉;凝膠性;紅外;響應(yīng)面優(yōu)化
中圖分類號:TS251.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號:1001-8123(2013)07-0020-06
血液進(jìn)行分離和噴霧干燥后,可以得到血球蛋白粉和血漿蛋白粉,其中血漿蛋白粉蛋白含量高,氨基酸豐富平衡,是一種等同于全蛋粉的蛋白原料[1-3]。目前國內(nèi)生產(chǎn)的血漿蛋白粉幾乎都是作為動物飼料使用的,而國外生產(chǎn)的血漿蛋白粉已經(jīng)可以加入食品當(dāng)中。相比而言,飼料級的血漿蛋白的應(yīng)用價值不及食品用的血漿蛋白粉。而國產(chǎn)血漿蛋白粉凝膠性不足是導(dǎo)致其品質(zhì)低于進(jìn)口產(chǎn)品的一個重要因素。
國內(nèi)外研究顯示,美拉德反應(yīng)除了可以應(yīng)用在食品風(fēng)味還可以應(yīng)用于接枝反應(yīng)[4]。對于蛋白質(zhì)易變性,難于改性的特點(diǎn),美拉德接枝反應(yīng)給科研人員提供了新的途徑。由于多糖在液相中能夠增稠和提高凝膠性,所以多糖的存在增加了膠體的穩(wěn)定性。于是一些研究者致力于用多糖與蛋白質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng)來改善蛋白質(zhì)的熱不穩(wěn)定性和其他功能特性[5]。因?yàn)檠獫{蛋白的研究與應(yīng)用較晚,所以關(guān)于蛋白質(zhì)與多糖的美拉德改性反應(yīng)的研究大多局限于于蛋清粉、大豆分離蛋白等。早期研究表明:蛋清蛋白質(zhì)與硫酸葡聚糖[6]、葡萄糖[7]、寡聚半乳糖醛酸[8]、半乳甘露聚糖[9]等糖類發(fā)生美拉德反應(yīng)后,其凝膠性質(zhì)均得到了很大的改善。
從理論上看,美拉德反應(yīng)第1步為氨基與羰基的縮合生成席夫堿,第2步為席夫堿經(jīng)過Amadori重排形成Amadori產(chǎn)物。因而血漿蛋白中豐富的氨基酸基團(tuán)可以與大量的外源羰基(麥芽糊精)縮合發(fā)生美拉德反應(yīng),所以通過這個反應(yīng)可以在血漿蛋白粉中引入多糖——麥芽糊精[10],從而顯著增強(qiáng)血漿蛋白粉的凝膠性。但是美拉德反應(yīng)第3步為裂解反應(yīng),理論上可起破壞此處的改性作用,因此,在實(shí)際反應(yīng)過程中,反應(yīng)進(jìn)程的控制顯得非常重要。通過王玉堃等[11]、蘇丹等[12]、徐志軍等[13]的研究,可以發(fā)現(xiàn)紅外技術(shù)相比于干熱技術(shù)在處理效果和處理時間上都要好,所以用紅外處理方式引發(fā)美拉德反應(yīng)為一個可行的研究方向。
本實(shí)驗(yàn)以溶解性、凝膠性等為考察指標(biāo),通過紅外加熱使得血漿蛋白粉和麥芽糊精混合粉中的氨基與羰基發(fā)生美拉德縮合反應(yīng),采用響應(yīng)面法優(yōu)化出最佳的血漿蛋白粉加工工藝條件。
1 材料與方法
1.1 原料與試劑
冷凍血漿蛋白粉 湖北安陸寶迪肉類食品有限公司。
麥芽糊精(食品級) 上海西王淀粉集團(tuán);酒石酸鈉、硫酸銅、氫氧化鈉均為分析純試劑。
1.2 儀器與設(shè)備
B-290型小型噴霧干燥機(jī) 瑞士Büchi公司;AM-50型紅外烤箱 深圳市輝躍機(jī)械設(shè)備有限公司;721型可見光分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;TA-XT Plus物性分析儀 英國Stable Micro Systems公司;CT14RD臺式冷凍高速離心機(jī) 美國Beckman公司;HH-S恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司;FA25高速乳化分散機(jī) 上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司;FA1104N型分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;WSC-S測色色差計(jì) 上海笛柏實(shí)驗(yàn)有限公司。
1.3 方法
1.3.1 溶解度檢測
采用雙縮脲法,將1g豬血漿蛋白粉溶于蒸餾水,配成一定pH值(用1mol/L NaOH溶液和1mol/L HCl溶液調(diào)節(jié))的溶液100mL(質(zhì)量濃度10mg/mL),勻漿機(jī)攪拌1min,然后4000r/min離心10min,取上清液1mL,加蒸餾水至3mL,再加入3mL雙縮脲試劑,靜置30min后于540nm波長下測其吸光度,以蒸餾水為參比液。配制質(zhì)量濃度為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0mg/mL的牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)溶液,在同樣條件下測其吸光度,繪制BSA溶液配制質(zhì)量濃度與其吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線,求出標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)方程y=ax+b,其中y為BSA配制質(zhì)量濃度,x為測得的吸光度。因?yàn)?0mg/mL BSA百分百溶解,所以配制質(zhì)量濃度為10mg/mL的血漿蛋白粉溶液的實(shí)際質(zhì)量濃度(y)可以由標(biāo)準(zhǔn)方程求出,血漿蛋白粉的溶解度(Y)可由下式計(jì)算:Y/%= y/10×100[14]。
雙縮脲試劑的配制:將3g酒石酸鈉和0.75g硫酸銅溶于250mL蒸餾水。攪拌下緩慢加入150mL10% NaoH溶液,最后定容至500mL。
1.3.2 凝膠強(qiáng)度檢測
測試條件為:測試前速5mm/s,測試速度2mm/s,測試后速5mm/s,測試距離為15mm,夾具為直徑0.5英寸的圓柱狀平頭探頭,凝膠強(qiáng)度用硬度(Hardness)即探頭下壓過程中的最大感應(yīng)力(g/cm2)表示[15]。
凝膠的制備方法:取2.25g蛋白粉放入50mL燒杯中→加入25mL蒸餾水→用高速均質(zhì)機(jī)均質(zhì),靜置消泡→用保鮮膜封口,并用橡皮筋扎緊→置于80℃水浴加熱40min→立即放入冰水中冷卻20min→存放于4℃冰箱中過夜→恢復(fù)到室溫→測定凝膠強(qiáng)度。
1.3.3 色差檢測
開機(jī)預(yù)熱30min,校零。把待測的粉末放入測量皿壓實(shí)。用測色色差計(jì)探頭進(jìn)行測量,平行測量3次取其平均值。
1.3.4 血漿蛋白粉制備工藝及步驟
因?yàn)樾迈r血液無法長時間保鮮,為了保證實(shí)驗(yàn)原材料的一致性,所以采用冷凍干燥制備的血漿蛋白粉復(fù)溶為濃縮血液,然后再進(jìn)行改性實(shí)驗(yàn)。血漿蛋白粉制備工藝如下:溶解血漿蛋白粉→添加麥芽糊精→過濾→噴霧干燥→稱量分裝→紅外改性→樣品檢測。
1)溶解血漿蛋白粉:按照10mL蒸餾水溶解1g血漿蛋白粉的比例配置血漿液;2)添加麥芽糊精:向血漿液中加入一定比例的麥芽糊精溶液并攪拌;3)過濾:使用濾布對血漿液進(jìn)行過濾,除去其中的較大顆粒;4)噴霧干燥:將上述血漿液進(jìn)行噴霧干燥,獲得噴霧干燥血漿蛋白粉;5)稱量分裝:根據(jù)單因素設(shè)置的不同水平試驗(yàn),對噴霧干燥血漿蛋白粉進(jìn)行稱量分裝,確保每一水平實(shí)驗(yàn)的蛋白粉質(zhì)量基本相同;6)紅外改性:將分裝好的蛋白粉放入紅外烤箱中進(jìn)行不同條件的紅外改性;7)樣品檢測:檢測改性后樣品的溶解度及凝膠性。
1.3.5 單因素試驗(yàn)
1.3.5.1 紅外時間對血漿蛋白粉性質(zhì)的影響
分別在紅外時間0、10、20、30、40、50、60、70min等條件下,固定麥芽糊精添加比例2%,紅外溫度90℃,研究紅外時間對血漿蛋白粉性質(zhì)的影響,并檢測其溶解度、凝膠強(qiáng)度和色差。
1.3.5.2 麥芽糊精添加量對血漿蛋白粉性質(zhì)的影響
固定紅外時間為1.3.5.1節(jié)中的最優(yōu)時間,紅外溫度90℃,研究麥芽糊精添加量對血漿蛋白粉性質(zhì)的影響。添加水平為:0.00%、0.25%、0.50%、1.00%、2.00%、4.00%。
1.3.5.3 紅外溫度對血漿蛋白粉性質(zhì)的影響
固定紅外時間為1.3.5.1節(jié)中的最優(yōu)時間,麥芽糊精添加比例為1.3.5.2節(jié)中的最佳添加比例,研究紅外溫度對血漿蛋白粉性質(zhì)的影響。溫度水平為:0(未紅外處理)、70、80、90、100、110℃。
1.3.6 響應(yīng)面試驗(yàn)
通過單因素試驗(yàn),得出各因素最優(yōu)水平,以凝膠性最為響應(yīng)值,對紅外時間,紅外溫度與麥芽糊精添加量3個因素設(shè)計(jì)試驗(yàn),使用Design Expert8.05軟件進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)。
2 結(jié)果與分析
2.1 BSA標(biāo)準(zhǔn)側(cè)曲線的測定與繪制
以1.0mg/mL為質(zhì)量濃度梯度,10mg/mL為最大質(zhì)量濃度,依次配置10個不同質(zhì)量濃度的BSA溶液。每組設(shè)置3個平行進(jìn)行吸光度測定。以每組3個平行測定的吸光度的平均值為x軸,以BSA質(zhì)量濃度為y軸來繪制BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線。
由圖1可知,隨著BSA質(zhì)量濃度的增加,相應(yīng)的吸光度也在增加,并且兩者有著線性關(guān)系。根據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)由Excel軟件程序可以計(jì)算出其標(biāo)準(zhǔn)曲線,求解出標(biāo)準(zhǔn)方程為y=25.871x-0.8073,其中y為BSA質(zhì)量濃度,x為測得的吸光度。標(biāo)準(zhǔn)方程的相關(guān)系數(shù)為0.9985,所以可以使用。
2.2 紅外時間對血漿蛋白粉的影響
2.2.1 紅外時間對血漿蛋白粉溶解度的影響
由圖2可知,隨著紅外時間的延長,血漿蛋白的溶解度先上升后下降,在60min以前其改性后的溶解度都高于原始樣,并且在20min時達(dá)到最高值,隨后逐漸下降,尤其是是紅外時間超過60min之后,改性后的血漿蛋白粉的溶解度急速下降,這可能是紅外時間加熱過長之后血漿蛋白變性造成的,因?yàn)檠獫{蛋白的變性溫度就在70~80℃之間。根據(jù)數(shù)據(jù)分析(F檢驗(yàn))顯示,紅外時間對血漿蛋白粉的溶解度影響顯著。
2.2.2 紅外時間對血漿蛋白粉色澤的影響
紅外時間對血漿蛋白粉色澤的影響試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。其中L值表示亮度,B值表示黃度。
由圖3可知,雖然數(shù)據(jù)變動幅度很小,但是趨勢很明顯。隨著紅外時間的延長,血漿蛋白粉的亮度值緩慢減小,而其黃度值緩慢變大。這是因?yàn)殡S著時間的加長,美拉德反應(yīng)的第3步反應(yīng)產(chǎn)物越來越多,導(dǎo)致血漿蛋白粉的亮度下降,黃度增加。根據(jù)數(shù)據(jù)分析(F檢驗(yàn))顯示,紅外時間對血漿蛋白粉的亮度與黃度影響顯著。
2.2.3 紅外時間對血漿蛋白粉凝膠性的影響
由圖4可知,隨著紅外時間的延長,血漿蛋白粉的凝膠性先升高后下降,在20min時取得峰值。當(dāng)紅外時間超過60min后,其凝膠強(qiáng)度會低于原始樣的凝膠強(qiáng)度,可見紅外時間過長時會對血漿蛋白粉起到負(fù)面作用的。根據(jù)數(shù)據(jù)分析(F檢驗(yàn))顯示,紅外時間對血漿蛋白粉的凝膠性影響顯著。
由圖2~4可知,紅外時間為20min時對血漿蛋白粉的改性效果較優(yōu),所以后續(xù)單因素試驗(yàn)紅外時間固定為20min。
2.3 麥芽糊精添加量對血漿蛋白粉的影響
2.3.1 麥芽糊精添加量對血漿蛋白粉溶解度的影響
由圖5可知,隨著麥芽糊精添加量的增加血漿蛋白粉的溶解度先增加后降低,在添加比例達(dá)到0.5%時出現(xiàn)峰值。當(dāng)麥芽糊精添加量超過1.0%后,血漿蛋白粉的溶解度會迅速下降并且低于原始樣。這可能的原因是美拉德反應(yīng)進(jìn)入了第3步。根據(jù)數(shù)據(jù)分析(F檢驗(yàn))顯示,麥芽糊精添加量對血漿蛋白粉的溶解度影響顯著。
圖5與圖2對比分析,圖5中麥芽糊精添加量為0.00%的血漿蛋白粉的溶解度為94.02%,圖2中紅外時間為0min的血漿蛋白粉的溶解度為85.32%,所以不加麥芽糊精紅外處理后的血漿蛋白粉比添加麥芽糊精而不紅外處理的血漿蛋白粉的溶解度好,可以推測麥芽糊精對血漿蛋白粉溶解度的影響與美拉德反應(yīng)有關(guān)。
2.3.2 麥芽糊精添加量對血漿蛋白粉色澤的影響
從圖6可知,隨著麥芽糊精添加量的增加,血漿蛋白粉的亮度與黃度值會出現(xiàn)小范圍的改變。亮度值先增加后下降,在添加量為0.5%時取得最大值,而黃度值則是一直增加。因?yàn)槊览路磻?yīng)的第3步是最終的反應(yīng),所以增加黃度的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物會不斷的積聚,所以黃度值會一直增加。而其亮度的波動,應(yīng)該是因?yàn)榉磻?yīng)底物濃度(羰基)在臨界點(diǎn)附近的改變而造成的。根據(jù)數(shù)據(jù)分析(F檢驗(yàn))顯示,麥芽糊精添加量對血漿蛋白粉的亮度與黃度影響顯著。
2.3.3 麥芽糊精添加量對血漿蛋白粉凝膠性的影響
由圖7可知,隨著麥芽糊精添加量的增加,血漿蛋白粉的凝膠強(qiáng)度先上升后下降,在添加量為0.5%時取得極值。而當(dāng)麥芽糊精的添加量達(dá)到4%時,其改性血漿蛋白粉的凝膠強(qiáng)度將低于原始樣的凝膠強(qiáng)度??梢婝溠亢砑恿窟^大會起到負(fù)面作用。根據(jù)數(shù)據(jù)分析(F檢驗(yàn))顯示,麥芽糊精添加量對血漿蛋白粉的凝膠性影響顯著。
由圖5~7可知,麥芽糊精添加量為0.5%時對血漿蛋白粉的改性效果較優(yōu),所以后面的單因素試驗(yàn)麥芽糊精添加量固定為0.5%。
2.4 紅外溫度對血漿蛋白粉的影響
2.4.1 紅外溫度對血漿蛋白粉溶解度的影響
由圖8可知,隨著紅外溫度的增加,血漿蛋白粉的溶解度會出現(xiàn)2個波峰,但是在110℃以內(nèi),紅外處理的血漿蛋白粉和原始樣對比溶解度都是提高的。由試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知,在紅外處理溫度為100℃時,血漿蛋白粉的溶解度有最高值,為95.24%。根據(jù)數(shù)據(jù)分析(F檢驗(yàn))顯示,紅外溫度對血漿蛋白粉的溶解度影響顯著。
2.4.2 紅外溫度對血漿蛋白粉色澤的影響
由圖9可知,隨著紅外溫度的改變,血漿蛋白粉的亮度與黃度會出現(xiàn)小幅度的改變,其中亮度緩慢減小,黃度緩慢增加,這個趨勢與圖5類似,都是由于美拉德反應(yīng)進(jìn)程而改變的。根據(jù)數(shù)據(jù)分析(F檢驗(yàn))顯示,紅外溫度對血漿蛋白粉的亮度與黃度影響顯著。
由圖3、6、9可知,紅外改性對血漿蛋白粉的影響趨勢為亮度減小、黃度增大,并且變化幅度很小。這是由于美拉德反應(yīng)的最終產(chǎn)物包含褐變物質(zhì),而褐變必然要降低其亮度,增加其黃度,所以色差對改性血漿蛋白的性質(zhì)評價意義也不大。但是在考察麥芽糊精添加量時,得到的臨界值0.5%周圍數(shù)值有一定參考意義。
2.4.3 紅外溫度對血漿蛋白粉凝膠性的影響
由圖10可知,隨著紅外溫度的加大,血漿蛋白粉的凝膠強(qiáng)度先增大后減小。在90℃時達(dá)到最大值,而當(dāng)紅外溫度大于100℃后,其凝膠強(qiáng)度將會低于原始樣的凝膠強(qiáng)度。這是美拉德反應(yīng)由第3步占據(jù)主導(dǎo)地位后導(dǎo)致的。根據(jù)數(shù)據(jù)分析(F檢驗(yàn))顯示,紅外溫度對血漿蛋白粉的凝膠性影響顯著。
由圖8~10可知,紅外溫度對血漿蛋白粉的色差影響不大;在100℃時其溶解度最大,但是前后溶解度差值很?。辉?0℃時其凝膠強(qiáng)度最大,并且前后測量值的差值很大。所以選取90℃為最佳紅外溫度。
由3個單因素試驗(yàn)可知,美拉德反應(yīng)的前期是可以起到改善作用的,但是到了反應(yīng)中期以后就會產(chǎn)生負(fù)面作用。3個單因素試驗(yàn)得到的最優(yōu)條件紅外時間20min、麥芽糊精添加量0.5%、紅外溫度90℃。雖然3個單因素試驗(yàn)都顯著,但是因?yàn)槠鋵?shí)際計(jì)算得到的溶解度除時間因素之外都是波動在0.05以內(nèi),原因可能為未變性的血漿蛋白粉溶解度很高,所以紅外改性對于血漿蛋白粉的溶解度的優(yōu)化作用相對較小[7],因此溶解度不能成為評判改性效果的主要因素。又因?yàn)?.4.2節(jié)分析得出結(jié)論:色差對改性血漿蛋白的性質(zhì)評價意義也不大,所以將凝膠強(qiáng)度作為后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)考察的唯一指標(biāo)。
2.5 響應(yīng)面結(jié)果與分析
利用Design-Expert8.0軟件,對表1試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,得到溫度(A)、時間(B)、麥芽糊精添加量(C)的二次回歸方程為:
凝膠強(qiáng)度/(g/cm2)=―1982.62491+41.59953A+20.40346B+245.78780C―0.13285AB―0.83909AC―5.01747BC―0.21085A2―0.16003B2―75.49142C2
該模型的方差分析結(jié)果見表2。
由表1、2可知,紅外溫度P<0.05,紅外時間P>0.05,麥芽糊精添加量P>0.05。說明紅外溫度對凝膠性的影響顯著,而紅外時間和麥芽糊精添加量的影響相對較小,則各因素影響凝膠性的大小順序?yàn)椋杭t外溫度>紅外時間>麥芽糊精添加量。失擬項(xiàng)不顯著即該模型在整個研究回歸區(qū)域擬合的較好。
由響應(yīng)面軟件運(yùn)算得到的推薦條件為:紅外溫度92.29℃,紅外時間16.62min,麥芽糊精添加量0.56%,推導(dǎo)出的凝膠強(qiáng)度為175.759g/cm2。實(shí)際操作將工藝條件修正為:紅外溫度92℃,紅外時間17min,麥芽糊精添加量0.56%。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在紅外溫度93℃、紅外時間17min、麥芽糊精添加量0.56%時,測得其凝膠強(qiáng)度為175.52g/cm2,基本吻合。
3 結(jié) 論
3.1 紅外能夠改善血漿蛋白粉的性質(zhì),其對改性血漿蛋白粉的溶解度和凝膠性有的改善作用,但是時間過長后會起負(fù)面影響,其對于血漿蛋白粉的色差影響不大。當(dāng)紅外時間為20min時,改性血漿蛋白粉的溶解度與凝膠性都取得最好值。
3.2 隨著麥芽糊精的添加比例的增加,其對改性血漿蛋白粉的溶解度、色差、凝膠性的影響都是先升高后降低,當(dāng)麥芽糊精添加比例為0.5%時,改性血漿蛋白粉的溶解度,亮度與凝膠性都會取到最優(yōu)值。
3.3 當(dāng)紅外溫度為100℃時,改性血漿蛋白粉的溶解度最好。但當(dāng)紅外溫度為90℃時,改性血漿蛋白粉的凝膠性最好。由于改性血漿蛋白粉的溶解度隨著紅外溫度的變化波動在0.05以內(nèi),而紅外溫度對于改性血漿蛋白粉的凝膠性的改變波動很大,所以參考下還是選擇90℃為最優(yōu)單因素溫度條件。
3.4 通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),推導(dǎo)出最優(yōu)紅外改性工藝條件,并通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。得出的最優(yōu)條件為紅外溫度92℃、紅外時間17min、麥芽糊精添加量0.56%,在此最佳條件下,血漿蛋白粉的凝膠值為175.52g/cm2,凝膠強(qiáng)度較對照組68.57g/cm2提高了1.56倍。
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