李鵬

摘 要：以豬氣管軟骨為原料，利用二次酶解法提取硫酸軟骨素，設(shè)計正交試驗對酶解工藝進行優(yōu)化，并測定了硫酸軟骨素的純度、含氮量、含氯化物量等主要指標(biāo)。結(jié)果表明：最佳工藝組合條件為溫度40℃，酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%，提取時間2.5h，在此條件下平均得率達(dá)到10.98%，純度達(dá)到85.22%。該工藝簡便易行，有望為工業(yè)生產(chǎn)提供參考。

關(guān)鍵詞：豬氣管；酶解；硫酸軟骨素；工藝優(yōu)化

Abstract： In this paper， the preparation of chondroitin sulfate （CS） by two-step enzymatic hydrolysis of swine trachea cartilage was optimized using orthogonal array design. The starting raw material was hydrolyzed sequentially by trypsin and a special-purpose enzyme preparation. The samples obtained were measured for purity and nitrogen and chloride contents. The optimal hydrolysis conditions were determined as 40 ℃， 1.5% of enzyme concentration and 2.5 h. Under these conditions， the average yield of CS was 10.98% and the purity was 85.22%. The optimized process is simple and easy to operate and can provide useful evidence for future industrial production.

Key words： swine trachea； enzymatic hydrolysis； chondroitin sulfate （CS）； process optimization

中國分類號：Q538 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2013）12-0001-04

硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）是一種酸性黏多糖，廣泛存在于哺乳動物的氣管、喉骨、鼻骨、舌骨和腿骨。硫酸軟骨素主要是由葡萄糖醛酸和氨基己糖交替連結(jié)而成的聚合物，通常為白色或微黃色粉末，具有很好的吸濕性，易溶于水而難溶于乙醇、丙酮等有機溶劑。硫酸軟骨素具有降血脂、抗凝血和抗腫瘤等生理功效，臨床上可用于預(yù)防動脈粥狀硬化及舒緩關(guān)節(jié)炎等[1-5]。同時還作為食品添加劑，用于食品的乳化和去異味等。此外，還可調(diào)節(jié)皮膚的細(xì)胞代謝，促進吸收營養(yǎng)，保持皮膚的水分[6-8]。

目前國內(nèi)外對硫酸軟骨素的研究主要集中在提取和功能性檢測方面。Garnjanagoonchorn等[9]通過對比鯊魚肋骨、氣管、舌骨和胸骨等不同部位的軟骨素含量和軟骨素種類，并進行紅外檢測，發(fā)現(xiàn)鯊魚胸骨和舌骨是軟骨素含量最高的軟骨，得率達(dá)到11.55～14.84g/100g。Miguel等[10]通過采用酶解和堿性水醇水解復(fù)合法，經(jīng)超濾后從背脊鰩中提取出高純度的硫酸軟骨素，純度達(dá)到99%；Nakanoa等[11]通過采用各種酶對肉雞中硫酸軟骨素進行提取、分離和藥用分析，發(fā)現(xiàn)胰酶是最佳的軟骨素分解酶，其分解的軟骨素和縮氨酸鏈與硫酸角質(zhì)素的抗原性高于獼猴桃中風(fēng)味蛋白酶的抗原性相比；丁璞等[12]對驢軟骨中硫酸軟骨素進行提取，確定了驢軟骨硫酸軟骨素提取最優(yōu)化的工藝條件，得率達(dá)到10.53%。至今已上市的硫酸軟骨素產(chǎn)品以膠囊、片劑和液體劑型存在，常與膠原蛋白、碳酸鈣、葡萄糖胺等成分混合而成，可見硫酸軟骨素的藥用價值極高。目前對硫酸軟骨素的提取方法有很多，主要包括中性鹽法、堿提取法、稀堿濃鹽提取法、酶提取法、超聲波法和乙酸抽提法等。酶解法產(chǎn)率、純度較高，生產(chǎn)周期較短，且對環(huán)境污染較小，是比較理想的制備方法[13-14]。同時選用豬氣管與豬喉管、鼻骨軟骨等相比，價格便宜。采用二次酶解法對豬氣管中硫酸軟骨素進行了提取研究，對企業(yè)資源進行整合利用再加工，提高其附加價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬鮮氣管 湖北寶迪農(nóng)業(yè)科技股份有限公司；胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、軟骨水解專用蛋白酶A4、2709堿性蛋白酶 南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司；LKA98cl樹脂 山東魯抗立科藥業(yè)有限公司；比濁用玻璃管 北京哲成科技有限公司；D-葡萄糖醛酸、咔唑、四硼酸鈉 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉、乙醇、硫酸鐵、硝酸銀、硫氰酸氨、硫酸肼、烏洛托品均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；FA1104電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；JJ-1精密增力電動攪拌器 常州普天儀器制造有限公司；實驗室pH計 梅特勒-托利多儀器有限公司；101型電熱鼓風(fēng)干燥機 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；U754可見分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 軟骨素提取流程

軟骨預(yù)處理→酶解→滅酶→吸附過濾→樹脂純化→醇沉→脫水→干燥→軟骨素樣品

1.3.2 酶解條件篩選

通過單因素試驗分析酶解種類及pH值、提取溶劑、酶解溫度、酶解時間、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)等因素對硫酸軟骨素的影響。酶解因素的條件：1）取一定量軟骨于燒杯中，一定比例加入自來水，采用二次酶解法進行酶解，以胰蛋白酶和軟骨素專用酶、胰性蛋白酶和木瓜蛋白酶、木瓜蛋白酶和軟骨素專用酶進行試驗，酶解溫度50℃，酶解2h，pH值在各自適宜范圍內(nèi)，重復(fù)3次，取平均值；2）以一定比例加入：a.等量自來水，b.甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，c.緩沖液，d.硼酸-氯化鉀緩沖液，e.硼砂-碳酸鈉緩沖液，其他實驗步驟同上；3）調(diào)節(jié)第一次酶解溫度分別為30、35、40、45、50、55℃，其他實驗步驟同上；4）調(diào)節(jié)第一次酶解的時間分別為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0h，其他實驗步驟同上；5）調(diào)節(jié)第一次酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.5%、0.8%、1.1%、1.4%、1.7%、2.0%，其他實驗步驟同上。

1.3.3 酶解最優(yōu)工藝

1.3.4 硫酸軟骨素指標(biāo)測定

1.3.4.1 硫酸軟骨素含量測定

硫酸軟骨素得率/% = 硫酸軟骨素粗品/軟骨原料×100

硫酸軟骨素純度檢測：采用稍加修飾的硫酸咔唑法[15-18]。

分別取配制好的D-葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度為0.1mg/mL）于10mL容量瓶內(nèi)，用去離子水定容，得到質(zhì)量濃度分別為10.0、20.0、30.0、40.0、50.0?g/mL和60.0?g/mL的D-葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后將裝有5.0mL硼砂-硫酸試劑的試管中，在冰浴條件下分別加入1.0mL不同質(zhì)量濃度的D-葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，同時用去離子水做空白對照，其間注意避免出現(xiàn)沸騰現(xiàn)象。沸水浴10min后迅速取出冷卻至室溫，加入0.2mL咔唑試劑，沸水浴后15min冷卻至室溫，在530nm處測定吸光度。根據(jù)吸光度（A）和D-葡萄糖醛酸質(zhì)量濃度（C）繪制其標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取一定量的硫酸軟骨素樣品，定容至10mL，按上述方法配成一定質(zhì)量濃度，測定其吸光度，根據(jù)吸光度（A）和硫酸軟骨素質(zhì)量濃度（C）繪制其曲線。

1.3.4.2 其他指標(biāo)的測定

水分、灰分、蛋白質(zhì)、氯化物含量：分別按國家標(biāo)準(zhǔn)GB 50093―2010《食品中水分的測定》、GB 50094―2010《食品中灰分的測定》、GB 50095―2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》和SC/T 3011―2001《水產(chǎn)品中鹽分的測定》進行檢測；澄清度和pH值測定參照《中華人民共和國藥典》2010年版二部；比濁度測定依據(jù)《中華人民共和國藥典》2000年版二部[13，19-20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酸軟骨素提取條件

2.1.1 酶種類選擇及其pH值

從表3可以看出，通過比較硫酸軟骨素得率，胰蛋白酶和軟骨素專用酶的二次酶解法效果最好，軟骨素平均得率達(dá)到9.26%，而胰蛋白酶最佳pH值為7.8～8.5，軟骨素專用酶的最佳pH值為8.8～9.1，所以要盡可能維持酶解在最適pH值范圍內(nèi)。

3 結(jié)論與討論

以1kg氣管軟骨為原料，按上述正交試驗優(yōu)化條件進行試驗，重復(fù)進行3次，得到的硫酸軟骨素的平均得率10.98%。

在豬氣管軟骨中，硫酸軟骨素通過苷鍵與蛋白質(zhì)等成分聚合在一起，在堿性條件下能破壞它們之間的苷鍵，而不會斷裂硫酸軟骨素分子上的硫酸基，從而改變軟骨素分子大小和結(jié)構(gòu)，保證了硫酸軟骨素的活性并讓其更好的釋放出來。在生產(chǎn)硫酸軟骨素過程中，若通過一次酶解，釋放出的CS仍可能連接多個氨基酸殘基或多肽，在后續(xù)純化中很難除去。同時豬氣管軟骨中化學(xué)成分復(fù)雜，含糖原、脂肪等雜質(zhì)，胰酶可將其水解成為醇溶性的小分子物質(zhì)，有利于硫酸軟骨素的分離提純；軟骨素專用酶是在堿性條件下通過?消除機理切斷氨基己糖和L-艾杜糖醛酸殘基之間的蛋白質(zhì)肽鍵的一類特定分解蛋白酶。若蛋白質(zhì)含量檢測較高，可再利用三氯醋酸去除蛋白，這樣可以增加硫酸軟骨素的純度。此外，由于樹脂的使用次數(shù)會使得各批次樣品顏色較黃，可采用雙氧水進行后續(xù)的脫色處理[21-22]。

本實驗首次通過采用胰蛋白酶和軟骨素專用酶對提取液進行兩步酶解，最終所得產(chǎn)品的純度較高，各項指標(biāo)均符合，達(dá)到軟骨素出口標(biāo)準(zhǔn)。在酶解過程中采用緩沖液進行提取，維持反應(yīng)液pH值，使得酶在最適宜的反應(yīng)條件?？梢?，通過整合利用企業(yè)自身的資源，將副產(chǎn)品變廢為寶，提高了其實用價值。

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