摘 要：為了建立一種基于實時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的肉及肉制品豬源性成分含量測定方法，分別以豬線粒體DNA 的NADH4基因和16S rRNA基因為靶位點設(shè)計豬特異性引物、探針和通用引物、探針，建立豬源性成分含量測定方法，通過特異性、靈敏性、線性、準(zhǔn)確度及市售肉制品檢測，對該方法體系進(jìn)行檢驗和評價。結(jié)果表明：建立的豬源性成分含量實時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測定方法體系具有良好的特異性及靈敏性，最低可檢測到0.4pg/μL純豬肉DNA；無論是豬特異性體系還是通用體系都呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系 （R2均達(dá)到0.999以上） 和較寬的線性范圍；通過含豬源性成分的模擬混合肉樣檢測，樣品豬源性成分含量的回收率平均值為122.27%，說明該方法具有較高的準(zhǔn)確度；通過市售肉制品檢測表明該方法可以用來檢測實際樣品（包括生鮮樣品和熟肉樣品）中豬源性成分含量。

關(guān)鍵詞：實時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；豬源性成分；定量；肉類摻假

Abstract： This study is aimed to establish a real time PCR （RT-PCR） method for quantitative determination of pork-derived ingredients in meat and meat products. The pork-specific primers， universal primers and TaqMan probes were designed for the mitochondrial NADH4 gene and 16S rRNA， respectively， and the established RT-PCR method was evaluated by specificity， sensitivity， linear relationship and accuracy by using it to detect commercial meat products. The method showed a good specificity and was able to detect 0.4 pg/μL pork DNA. Both pork-specific and universal systems showed a good linear relationship （R2 > 0.999） and a wide linear range. The PCR method showed a high accuracy and the average recovery of pork-derived ingredients in meat mixtures was 122.27%. It can be used to test both raw and processed pork products.

Key words： real time PCR； pork-derived ingredients； quantification； meat adulteration

中圖分類號：TS207.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2013）12-0011-05

近年來，由于價格差異帶來的巨大利益誘惑導(dǎo)致肉類食品“摻雜使假”事件頻發(fā)，不僅嚴(yán)重侵害消費者利益，而且對肉類產(chǎn)業(yè)造成了巨大傷害。不僅國內(nèi)此類事件頻發(fā)，國際肉類市場也普遍存在肉類食品摻假情況。2013年1月，歐洲暴發(fā)的“馬肉”風(fēng)波，多個歐洲國家卷入其中，極大降低了肉類消費信心，也給我國肉類進(jìn)口帶來了極大的安全隱患。

目前，動物源性成分檢測技術(shù)通常建立在對樣品蛋白質(zhì)、DNA、脂肪酸等分子結(jié)構(gòu)、序列或組成特異性分析的基礎(chǔ)上[1]。蛋白質(zhì)的肉種鑒定方法多采用免疫學(xué)技術(shù)對肌鈣蛋白Ⅰ、h-鈣調(diào)素結(jié)合蛋白等具有物種特異性的物質(zhì)進(jìn)行檢測來判定樣品中是否含有某種肉種成分[2-3]。但蛋白質(zhì)的肉種鑒定方法具有較大的局限性[4-5]，一般不作為標(biāo)準(zhǔn)制定方法或仲裁鑒定方法，通常作為快速篩查方法使用。與蛋白質(zhì)分子相比，DNA分子除了具有種內(nèi)保守性高，種間特異性強(qiáng)的優(yōu)點外還具有較高的熱穩(wěn)定性，可獨立用于物種判別依據(jù)。目前，基于DNA序列特異性的鑒別技術(shù)中，基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）的動物源性成分檢測技術(shù)逐漸成為了發(fā)展方向和研究熱點，主要包括有PCR-電泳法[6-8]、PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism（RFLP）法[9-11]、PCR測序法[12， 13]、隨機(jī)引物的擴(kuò)增法[14]、實時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time fluorescent polymerase chain reaction，RT-PCR）法[15-18]等。在眾多技術(shù)中由于RT-PCR具有靈敏度、準(zhǔn)確性和重復(fù)性等重要性能參數(shù)上無可比擬的優(yōu)勢，成為該領(lǐng)域的研究熱點和趨勢，是作為仲裁方法和司法鑒定的理想技術(shù)類型和現(xiàn)行國家[19]和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[20]中指定的主要方法之一。

目前現(xiàn)有的物種鑒別技術(shù)，無論是國家、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)還是商業(yè)試劑盒，都只能完成定性測定，即只能判定樣品中是否含有某種動物DNA成分，結(jié)果以陰性或陽性的形式報告。而現(xiàn)實問題是存在摻假的食品中通常是混合制品，例如豬肉串刷上羊油變羊肉串、醬豬肉泡過牛肉膏變牛肉等，多多少少都會含有一定標(biāo)簽主體成分，因此使用現(xiàn)有方法無法區(qū)分是無意污染還是故意添加所致，這也是不法分子慣用借口之一，也就無法有效甄別是否存在摻假行為及其嚴(yán)重程度。因此研發(fā)出定量檢測技術(shù)，即肉種摻假量化鑒別技術(shù)對解決肉類摻假問題，加強(qiáng)食品保護(hù)，保護(hù)消費者和相關(guān)進(jìn)口貿(mào)易企業(yè)利益十分必要，也有巨大市場需求。本實驗利用豬特異性

RT-PCR反應(yīng)和通用體系RT-PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)系，開發(fā)一種基于RT-PCR的肉及肉制品中豬源性成分百分含量檢測方法，基本實現(xiàn)了豬源成分的量化鑒別，為相關(guān)部門解決肉制品摻假問題的定性量刑難題，提供可靠的技術(shù)手段和執(zhí)法依據(jù)，具有廣闊的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬四號肉 北京資源公司；牛肉 北京御香苑畜牧有限公司；羊肉 內(nèi)蒙古金戈爾有機(jī)畜牧有限公司；狗肉、兔肉、鹿肉、驢肉、雞肉、鴨肉、魚肉 市購。

DNA提取主要試劑：裂解液：1% CTAB、0.05mol/L Tris-HCl（pH8.0）、0.7mol/L NaCl、0.01mol/L EDTA （pH8.0）；TE緩沖液（Tris-HCl，EDTA 緩沖液）：10mmol/L、Tris-HCl（pH8.0）、1mmol/L EDTA （pH8.0）；三氯甲烷：異戊醇（24：1，V/V）、異丙醇、70% 乙醇；滅菌雙蒸水 北京華力基科技有限公司。

RT-PCR反應(yīng)試劑：TaKaRa 2×酶體系預(yù)混液 大連寶生物工程（大連）有限公司；RT-PCR 96孔板 羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FSP-625勻漿機(jī) 日本Nihonseiki Kaisha公司；BT224S分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；S-100 渦旋振蕩器 大洋科學(xué)工業(yè)株式會社；HGDS-250 恒溫恒濕試驗箱 上海一實儀器設(shè)備廠；Eppendorf 5417 C/R 型離心機(jī) 艾本德中國有限公司；UV-2800 紫外-可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；GI54DWS 全自動高壓滅菌器 美國致微（廈門）儀器有限公司；LightCycler 480 熒光PCR儀 羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司等。

1.3 方法

1.3.1 肉類組織DNA提取方法[21]

將肉去筋膜、剪碎，按照肉：水=1：4（m/m）準(zhǔn)確稱取并進(jìn)行勻漿，勻漿機(jī)轉(zhuǎn)速12000r/min，勻漿時間8min，吸取100μL勻漿液于1.5mL離心管中，加入800μL裂解液，65℃孵育30min，期間不時振蕩混勻。12000×g 4℃離心5min，轉(zhuǎn)移600μL上清液于潔凈離心管中，加入400μL三氯甲烷：異戊醇（24：1，V/V），振蕩混勻后，12000×g 4℃離心5min，取400μL上清液于潔凈離心管中，加320μL異丙醇，4℃條件下沉淀30min。12000×g離心5min，棄掉上清液，然后用500μL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液洗滌，棄掉上清液，晾干，加入100μL TE緩沖液，4℃過夜，溶解沉淀。通過紫外-可見分光光度計檢測DNA的純度及濃度。

1.3.2 實時熒光PCR檢測

1.3.2.1 引物和探針設(shè)計

利用Matlab R2007a軟件將不同物種線粒體DNA 16S rRNA基因?qū)R比較，選取物種間序列保守區(qū)域運用引物設(shè)計軟件Oligo 7.0設(shè)計通用引物和TaqMan探針，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為125 bp。對不同物種線粒體DNA NADH4基因進(jìn)行對齊比較，選取物種間序列變異大的區(qū)域進(jìn)行豬特異性引物和探針的設(shè)計，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為120 bp。

引物和TaqMan探針由生工生物工程（上海）有限公司合成，引物和探針序列見表1。

1.3.2.2 RT-PCR反應(yīng)

RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)的10μL反應(yīng)體系見表2，DNA模板2μL，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足體系。

PCR反應(yīng)體系在熒光PCR儀中反應(yīng)的程序是預(yù)變性95℃、30s；變性95℃、10s；退火和延伸60℃、45s；40個循環(huán)；最后40℃冷卻60s。

1.3.2.3 基于RT-PCR測定樣品中豬源性成分含量的方法

提取標(biāo)準(zhǔn)豬肉樣品DNA，稀釋至少5個濃度梯度作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，濃度跨度范圍可根據(jù)實際需求調(diào)整。

采用表1豬特異性引物和通用引物對待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線DNA模板，在1個PCR板上的不同反應(yīng)管同時進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，按照表3進(jìn)行加樣；然后按照公式1計算出待測樣品中豬源性成分含量。

3 討 論

本實驗建立的肉及肉制品豬源性成分含量的RT-PCR測定方法具有準(zhǔn)確性高，穩(wěn)定性好，檢出限低的優(yōu)點，但由于整個試驗流程包括肉樣前處理、DNA提取和RT-PCR檢測等主要步驟，所以存在一定相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，仍需測定其他肉種成分含量作為主成分定量的輔助判定。

線粒體DNA廣泛大量的存在于動物細(xì)胞中，并且同時具有高變異性和高保守型區(qū)域，因此被認(rèn)為高度適用于物種鑒別技術(shù)[22]。本實驗建立的豬源性成分含量測定方法選擇線粒體DNA的片段基因作為擴(kuò)增靶序列，但是，由于不同動物組織含有的線粒體和線粒體DNA的數(shù)量差別很大[23]，所以DNA的含量并不能完全代表肉的質(zhì)量百分比。但通過對不同物種、部位、個體的DNA含量進(jìn)行大量統(tǒng)計調(diào)研，掌握各指標(biāo)的分布區(qū)間，對測定結(jié)果進(jìn)行修訂，可以在一定范圍內(nèi)實現(xiàn)方法準(zhǔn)確度的提高。

本實驗建立的方法體系對熟肉樣品進(jìn)行檢測，可能會由于加工過程中高溫對肉類DNA造成不同程度的斷裂、加工中各種香辛料及調(diào)味品的添加等原因，造成測定結(jié)果偏低，后續(xù)實驗中，將針對熱加工的溫度和時間、擴(kuò)增靶序列長度、靶序列堿基組成等對DNA片段破壞程度和PCR擴(kuò)增的影響進(jìn)行更深入的研究。

4 結(jié) 論

本實驗研究、建立的以雙引物（物種特異性引物和通用引物）為基礎(chǔ)的肉及肉制品豬源性成分含量的RT-PCR測定方法體系，最低可檢測到0.4pg/μL純豬肉DNA；無論是豬特異性體系還是通用體系都呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（R2均達(dá)到0.999以上）和較寬的線性范圍；通過含豬源性成分的模擬混合肉樣檢測，樣品豬源性成分含量的回收率平均值122.27%。該方法體系具有準(zhǔn)確性高，穩(wěn)定性好，檢出限低等優(yōu)點，有效解決了無法判斷是否具有摻假行為及嚴(yán)重程度的難題，達(dá)到了國際先進(jìn)水平，同時為相關(guān)執(zhí)法部門進(jìn)一步加強(qiáng)監(jiān)管、減少摻假、欺詐行為的發(fā)生提供了可靠的技術(shù)支持和執(zhí)法依據(jù)。

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