任軍方 姜殿強 覃瓊瑤 云勇

摘 要：以安諾蘭為試驗材料，研究改良的CTAB法對安諾蘭不同部位（老葉、嫩葉、氣生根、花序、花苞）進行基因組DNA的提取，利用核酸蛋白測定儀和瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。結果表明，安諾蘭嫩葉的DNA提取從純度和提取率均優(yōu)于其他部位；花苞次之；花序DNA提取有少量的雜質(zhì)污染， 老葉有少量RNA殘留， 氣生根則質(zhì)量低。

關鍵詞：安諾蘭；DNA提取；ISSR

中圖分類號 Q949.71+8.43 文獻標識碼 B 文章編號 1007-7731（2013）09-22-03

安諾蘭（Anota hainanensis RolfeSchltr），又名海南鉆喙蘭，是蘭科安諾蘭屬唯一的一個種，是海南特有種，為多年生常綠附生亞灌木狀草本植物，屬典型的熱帶附生蘭。產(chǎn)于海南中南部低海拔丘陵地區(qū)，其性喜高溫、通風、光照充足的氣候環(huán)境，耐干旱，畏濕，畏寒冷，春節(jié)前后開花，是春節(jié)期間頗受歡迎的賀歲應節(jié)蘭花品種。因具有很高的觀賞和藥用價值，其野生資源被掠奪性采伐，造成資源枯竭。目前對海南安諾蘭的研究主要在其栽培[1]和組織培養(yǎng)[2]等方面，尚未見報道有關海南安諾蘭種質(zhì)資源收集、遺傳多樣性的研究。

ISSR（Inter Simple Sequence Repeat，簡單重復序列間擴增）是由Zietkiewicz等[3]人于1994年提出的一種新的分子標記技術，該技術具有快速、穩(wěn)定性、多態(tài)性高、重復性好等優(yōu)點[4]。ISSR標記通常為顯性標記[5]，具有很好的穩(wěn)定性、多態(tài)性[6]，而且無需預知研究對象的基因組序列而設計特異引物，操作簡單，因此該技術已廣泛應用于品種鑒定[7]、基因定位及遺傳多樣性分析中[8-9]。高質(zhì)量的總DNA及穩(wěn)定的PCR反應體系是獲取可靠分子標記結果的前提[10]，為此，筆者擬研究獲得高質(zhì)量安諾蘭基因組DNA的提取方法，并建立安諾蘭ISSR反應體系，為該分子標記技術在海南安諾蘭種質(zhì)資源研究和遺傳育種中的應用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 供試材料來自于海南省農(nóng)業(yè)科學院園林花卉研究所蘭圃的安諾蘭，選取安諾蘭不同部位—老葉、嫩葉、氣生根、花序、花苞為材料。

1.2 DNA提取方法優(yōu)化 經(jīng)過改良的CTAB提取方法：（1）取材料1g加少量的PVP，在液氮中研磨至白色粉末狀，將粉末迅速轉入2.0mL的離心管中，放入冰盒備用。（2）每份樣品加入1.5mL 60℃預熱的DNA提取緩沖液，輕輕搖勻，放在冰上。（3）等所有提樣品都研磨完以后，12 000rpm，4℃，離心5min，丟棄上清液。（4）加入約750mL預熱60℃的裂解緩沖液，充分搖勻，65℃水浴45min，每隔20min搖1次，使其充分混勻。（5）加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1）提取液搖勻至白色乳濁狀，用10 000rpm，25℃，離心20min；將上清液轉入新的2mL離心管中。（6）加入1/10體積3M乙酸鈉（pH5.2）和0.6倍體積的預冷異丙醇，緩慢搖勻至有絮狀沉淀物析出，常溫下靜置至少1h。（7）用6 000rpm，25℃，離心15min，倒掉上部液體，用75%乙醇洗3次，通風櫥柜風干后加入200μL×TE溶解DNA。（8）加入10μg/μL的Rnase 3μL，37℃水浴1h。（9）加入等體積酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）抽提液，搖床輕輕搖30min。（10）用10 000rpm，25℃，離心15min，將上清液體轉入新的2mL離心管。（11）加入等體積的氯仿：異戊醇（24∶1）抽提液再抽提一次。（12）用10 000rpm，25℃，離心15min，將上清液轉入新的2mL離心管，加入1/10體積的3M乙酸鈉（pH5.2）和2倍體積的冰凍無水乙醇，慢慢搖勻至沉淀物析出，用槍頭挑出沉淀，用75%乙醇洗3次，至無乙醇味道，在通風櫥柜風干1～2h，DNA呈薄片透明狀時加入50μL×TE溶解。輕輕彈，至樣品完全溶解，放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 DNA樣品檢測

1.3.1 紫外光譜檢測 用超純水稀釋少量基因組DNA（稀釋100倍），并用超純水作為空白，利用紫外分光光度計檢測OD260/OD280比值及DNA的濃度。DNA樣品按100倍稀釋后測定其在260nm和280nm處的紫外吸收值，OD260/OD280的比值表示DNA樣品的純度，可判斷有無蛋白質(zhì)、多糖、RNA等雜質(zhì)（王關林等，2002）。若OD260/OD280值介于1.8～2.0，則表明DNA純度較好，如果OD260/OD280小于1.8，表明有蛋白質(zhì)污染；若OD260/OD280值大于2.0，表明DNA樣品里面有RNA污染。然后根據(jù)OD比值計算出DNA的濃度和提取率。計算公式為：DNA濃度（μg/μL）=D260nm×100×稀釋倍數(shù)/1 000；DNA提取率（μg/g）=DNA濃度（μg/uL）×提取的DNA體積（μL）/試驗材料的用量（g）。DNA濃度（μg/mL）=OD260×樣品稀釋倍數(shù)×100。將檢測后的DNA，稀釋至30ng/μL，放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測 取1μL稀釋好的DNA樣品，每個樣品加入5μL10×loading buffer混勻，于0.8%瓊脂糖凝膠電泳，電壓100V，電泳40min，電泳結束后用凝膠成像分析系統(tǒng)（Tanon4100）觀察DNA譜帶，并拍照。

1.4 ISSR-PCR反應產(chǎn)物的檢測 ISSR-PCR產(chǎn)物的檢測：反應產(chǎn)物在含有0.5μg/mLGoldview染料的1.8%瓊脂糖凝膠電泳中分離，用DNA Marker（2 000bp）作為相對分子量標記，以100V電壓電泳60min，在紫外凝膠成像系統(tǒng)（Tanon4100）下觀察并照相。

擴增程序參照Zietkiewicz等（1994），具體為：95℃預變性5min；94℃變性40s，引物在篩選后的最佳退火溫度退火55s，72℃延伸1min30s，共計36個循環(huán)，循環(huán)結束后72℃延伸7min。PCR擴增在Biometra公司的T1PCR儀上進行擴增。

2 結果與分析

2.1 DNA提取結果與檢測 經(jīng)過改良的CTAB法提取的安諾蘭基因組DNA呈白色絮狀，通風櫥柜自然吹干后為白色透明薄片狀，加入3%β-巰基乙醇和2%PVP40，避免了多糖、多酚等次生物質(zhì)的擾亂，有效防止了褐變。經(jīng)過紫外分光光度計檢測DNA的OD值，其OD值都在1.799～2.300，說明該法能較完全地去除蛋白質(zhì)、酚類及多糖等雜質(zhì)，對殘留的氯仿、無機鹽等也能去除干凈，適合對安諾蘭DNA基因組的提取。

用0.8%的瓊脂糖膠檢測提取的DNA的質(zhì)量表明：用改良的CTAB法提取的安諾蘭基因組DNA在瓊脂糖凝膠電泳上能呈現(xiàn)清楚的DNA光亮條帶，不彌散，沒有拖尾現(xiàn)象（圖1）。

圖1 安諾蘭DNA0.8%瓊脂糖凝膠電泳圖

注：1～4為安諾蘭花序；5～8為安諾蘭嫩葉；9～12為安諾蘭苞葉；13～16為安諾蘭氣生根；17～20為安諾蘭老葉。

2.2 不同部位DNA的純度和提取率 用紫外分光光度計檢測各個處理的DNA的D260nm、D280nm值，分別計算出D260nm/D280nm、DNA濃度和提取率（表1）。結果表示，安諾蘭嫩葉提取率和純度都很高，D260nm/D280nm處于1.8～2.0，老葉的D260nm/D280nm大于2.0，表明樣品還有RNA污染，須進一步除RNA。從提取率看嫩葉的提取率最高，其次是苞葉和花序，氣生根和老葉純度和提取率均很低。

3 結論與討論

研究結果，安諾蘭不同部位DNA的提取純度都很高，表明安諾蘭的5個不同部位都可以進行DNA的提取，但是DNA提取濃度和提取率各不相同，嫩葉的提取率最高，苞葉和花序次之，老葉和氣生根提取率低。安諾蘭的老葉由于提取率低，有雜質(zhì)污染，且質(zhì)地較硬，很難研磨，最好不選用進行DNA的提取。氣生根提取率也不高，且根系損傷對植株生長影響較大，為不使整株受影響，根系提取DNA也不可行。苞葉和花序可作為安諾蘭DNA提取的選擇材料，但以嫩葉的提取率最高，且純度好，提取過程中要注意RNA的污染。

本實驗用改良的CTAB法適合安諾蘭基因組DNA的提取，且DNA的質(zhì)量好，純度高，完全能滿足安諾蘭ISSR-PCR擴增的要求。

參考文獻

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（責編：張宏民）