張志勇　詹先進(jìn)等

摘要：概述了SSR標(biāo)記在棉花（Gossypium spp.）的指紋圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析、品種純度檢測(cè)、品種間差異性相關(guān)分析等方面的研究進(jìn)展，并對(duì)其應(yīng)用前景進(jìn)行了展望，旨在為今后的研究提供借鑒。

關(guān)鍵詞：棉花（Gossypium spp.）；SSR標(biāo)記；品種；純度

中圖分類號(hào)：Q503；S562 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）09-1992-03

棉花是中國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)新品種的選育在棉花產(chǎn)業(yè)發(fā)展中至關(guān)重要。目前，雜交棉花品種在生產(chǎn)上居主導(dǎo)地位，優(yōu)良的抗蟲(chóng)雜交棉花品種是農(nóng)民增產(chǎn)增收的基礎(chǔ)。大多數(shù)優(yōu)勢(shì)雜交棉花品種是通過(guò)人工去雄制種，制種過(guò)程中，母本因去雄不徹底或漏去雄易形成自交鈴，這將嚴(yán)重影響雜交種純度。如果不及時(shí)準(zhǔn)確地進(jìn)行鑒定，則會(huì)給棉花生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重的損失。因此，雜交棉花品種快速、準(zhǔn)確而高效的純度檢測(cè)，對(duì)于雜交棉花品種的推廣應(yīng)用意義重大[1]。棉花品種純度的檢測(cè)方法有種子形態(tài)學(xué)、幼苗鑒定、蛋白質(zhì)電泳以及田間小區(qū)種植鑒定等方法[2]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，各種基于DNA的新型分子標(biāo)記的出現(xiàn)推動(dòng)了DNA指紋圖譜技術(shù)的快速發(fā)展。DNA指紋圖譜的多態(tài)性反映了基因組DNA間的差異，這種差異受環(huán)境影響較小、數(shù)量多，具有高度的個(gè)體特異性。SSR即簡(jiǎn)單序列重復(fù)，又稱微衛(wèi)星DNA，是一類由幾個(gè)核苷酸為重復(fù)單位組成的簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)序列。由于SSR多態(tài)性豐富，而且覆蓋整個(gè)基因組的編碼區(qū)和非編碼區(qū)，成為一種新興分子標(biāo)記[3]。棉花基因組中存在著豐富的SSR標(biāo)記，SSR標(biāo)記以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，已被廣泛用于棉花的遺傳圖譜構(gòu)建、目標(biāo)基因定位、遺傳多樣性分析、種質(zhì)鑒定及分子標(biāo)記輔助選擇等方面的研究。本文概述了利用SSR標(biāo)記鑒定棉花品種和純度的研究進(jìn)展，皆在為今后的研究提供一定參考。

1 SSR標(biāo)記鑒定不同棉花品種

2001年武耀廷等[4]用48對(duì)SSR引物對(duì)30個(gè)棉花常規(guī)品種、4個(gè)雜交品種及其親本進(jìn)行了多態(tài)性篩選。結(jié)果表明，有27對(duì)引物檢測(cè)到了多態(tài)性，SSR3442、SSR2495、SSR3347和SSR1231引物能夠?qū)⑾骐s2號(hào)、皖雜40、中棉所28、南抗3號(hào)及親本等30個(gè)常規(guī)品種區(qū)分開(kāi)來(lái)，并用SSR標(biāo)記對(duì)栽培品種、雜交品種及親本進(jìn)行了多態(tài)性篩選，然后根據(jù)栽培品種及親本SSR指紋圖譜的差異，建立了棉花雜交品種的特征指紋圖譜，應(yīng)用于雜交品種的分子鑒定和純度檢測(cè)。朱美霞等[5]應(yīng)用引物組合法，對(duì)86-1號(hào)、冀棉668、新棉99B、中棉19及中棉12進(jìn)行了純度分析，用特性好的引物J120、J108、J182進(jìn)行三重引物組合對(duì)5個(gè)品種的250個(gè)單株進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，三重引物組合不僅可以快速檢測(cè)棉花品種的純度而且可以減少試驗(yàn)工作量。張玉翠等[6]以中國(guó)3大棉區(qū)8個(gè)棉花主產(chǎn)?。ㄗ灾螀^(qū)）的32個(gè)棉花主栽品種為材料，利用SSR標(biāo)記進(jìn)行DNA指紋圖譜的構(gòu)建和遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，長(zhǎng)江流域棉區(qū)品種間差異最大，黃河流域棉區(qū)次之，新疆棉區(qū)最小，常規(guī)棉種遺傳基礎(chǔ)相較于雜交棉種的遺傳基礎(chǔ)窄。

2 SSR標(biāo)記鑒定棉花品種純度

棉花是常異花授粉作物，其雜交制種容易發(fā)生混雜。為了鑒定棉花品種純度，劉勤紅等[3]以轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)雜交棉魯棉研15號(hào)母本、父本及其F1代為材料，通過(guò)篩選217對(duì)棉花異源四倍體的SSR引物，獲得了十幾個(gè)區(qū)分魯棉研15號(hào)親本及其F1代的標(biāo)記位點(diǎn)，為魯棉研15號(hào)雜交種的純度鑒定提供了方法。但該方法不能將魯棉研15號(hào)與其他雜交組合區(qū)分開(kāi)，因?yàn)檫€需要對(duì)其親本進(jìn)行指紋分析，只有獲得了雙親特異的分子標(biāo)記，才能夠?qū)υ撈贩N進(jìn)行指紋分析，從而鑒定出假冒種子。殷劍美等[1]利用美國(guó)Research Genetics公司設(shè)計(jì)的217對(duì)專用微衛(wèi)星引物，以蘇雜118及其母本、父本為材料，篩選出12對(duì)具有多態(tài)性的引物，其中7對(duì)引物在兩親本間擴(kuò)增出大小不同的條帶，均在F1代中表現(xiàn)為雜合帶共顯性標(biāo)記，并構(gòu)建了蘇雜118的SSR指紋圖譜，可將蘇雜118與其他雜交組合區(qū)分開(kāi)，還可有效區(qū)分蘇雜118兩親本和雜交F1代的基因型，從而進(jìn)行種子純度檢測(cè)。為進(jìn)一步研究棉花SSR指紋圖譜，潘兆娥等[7]以雜交棉品種中棉所48及其母本、父本和高世代自交系陸地棉TM-l為材料，利用25對(duì)核心引物對(duì)中棉所48及其親本進(jìn)行多態(tài)性篩選，共16對(duì)引物在兩親本間具有多態(tài)性，其中，14對(duì)引物在兩親本間擴(kuò)增出大小不同的條帶，均在F1代中表現(xiàn)為雜合帶共顯性標(biāo)記。用不同材料擴(kuò)增得到的二進(jìn)制數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成十進(jìn)制數(shù)據(jù)，構(gòu)建了雜交棉中棉所48的數(shù)字指紋圖譜，為該品種的真?zhèn)舞b定和純度檢測(cè)提供了方法。

3 SSR標(biāo)記鑒定棉花品種應(yīng)用研究

為進(jìn)一步研究SSR標(biāo)記技術(shù)在棉花品種純度鑒定中的可行性、可靠性和科學(xué)性，科研人員正在積極探索。許蘭杰等[8]以雜交棉花品種興雜2號(hào)的父本、母本、雜交株F1代和F2代為材料，選用77對(duì)棉花異源四倍體的SSR引物，采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)篩選出雙親間的多態(tài)性，結(jié)果有4對(duì)引物在興雜2號(hào)雙親間擴(kuò)增出多態(tài)性產(chǎn)物，準(zhǔn)確地鑒定出興雜2號(hào)及其親本間的差異。其中，CP483引物擴(kuò)增出的兩株雜交株帶型和親本P2帶型完全一致，表明此兩株雜交株是母本去雄不徹底或漏去雄而自交結(jié)子長(zhǎng)成的植株。李育強(qiáng)等[9]以12個(gè)湘雜棉系列品種（湘雜棉2號(hào)至湘雜棉13號(hào)）及兩個(gè)對(duì)照（雜交棉品種魯棉研19和中棉所36）為材料，選擇棉花26對(duì)染色體上的331對(duì)SSR引物，對(duì)湘雜棉系列品種及其部分親本進(jìn)行SSR分析，選擇19對(duì)多態(tài)性好、條帶易讀取的SSR引物構(gòu)建了湘雜棉品種指紋圖譜。根據(jù)19對(duì)多態(tài)性引物的擴(kuò)增條帶，計(jì)算相似系數(shù)并進(jìn)行聚類分析，開(kāi)展了利用湘雜棉指紋圖譜對(duì)未知種身份識(shí)別的研究，并用單引物SSR003對(duì)湘雜棉2號(hào)進(jìn)行了品種純度檢測(cè)?？锩偷萚10]以中棉所72、中棉所66、中棉所52、中棉所48、中棉所47和中棉所75為材料，選擇棉花26條染色體上的36對(duì)SSR核心引物，篩選雙親互補(bǔ)型雜合帶型作為純度檢測(cè)標(biāo)記，采用單位點(diǎn)平均法與雙位點(diǎn)差異法統(tǒng)計(jì)SSR標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果；在棉鈴期考察棉花株型、鈴形、葉形、花及莖等性狀，比對(duì)田間表型與分子檢測(cè)結(jié)果，并進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，有34對(duì)核心引物在6個(gè)雜交株上獲得101個(gè)雜合位點(diǎn)，平均每個(gè)雜交株具有16.8個(gè)。田間表型鑒定結(jié)果高于分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果，單位點(diǎn)平均法的相關(guān)性高于雙位點(diǎn)差異法。純合度高的親本將會(huì)增加分子標(biāo)記鑒定結(jié)果與表型鑒定結(jié)果的相關(guān)性，為DNA指紋技術(shù)應(yīng)用于棉花品種鑒定做了基礎(chǔ)性研究。

4 展望

隨著雜交棉花品種的逐漸增多以及親本間遺傳基礎(chǔ)日漸狹窄，采用田間調(diào)查品種性狀的方法因耗時(shí)長(zhǎng)、成本高、效果差而特別容易受到環(huán)境條件的影響。而以分子標(biāo)記為基礎(chǔ)的DNA指紋鑒定技術(shù)具有準(zhǔn)確、快速、易于操作等優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)構(gòu)建DNA指紋圖譜快速鑒定品種及純度是品種鑒定技術(shù)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的前提，成為品種鑒定技術(shù)的研究熱點(diǎn)。以微衛(wèi)星為基礎(chǔ)的SSR標(biāo)記在DNA指紋鑒定上顯示了特有的優(yōu)越性，已在大豆[11]、水稻[12]、小麥[13]、玉米[14]和油菜[15]等主要農(nóng)作物上進(jìn)行應(yīng)用研究。目前利用SSR標(biāo)記方法對(duì)棉花品種鑒定的研究有很多報(bào)道，被研究的棉花品種覆蓋面廣，涉及中國(guó)3大棉區(qū)，為今后棉花品種純度檢測(cè)打下了基礎(chǔ)。在品種選育過(guò)程中常因親本自交代數(shù)不夠，存在親本未完全純合穩(wěn)定的現(xiàn)象，導(dǎo)致某些遺傳位點(diǎn)還存在變異，但這些未純合的位點(diǎn)不一定直接反映在表型性狀上，因此使用這些未純合的標(biāo)記位點(diǎn)進(jìn)行純度檢測(cè)的結(jié)果往往與田間形態(tài)鑒定的結(jié)果存在差異。為進(jìn)一步提高SSR標(biāo)記鑒定棉花品種的準(zhǔn)確性，仍需要對(duì)特異性引物進(jìn)行不斷篩選，結(jié)合不同棉花品種間表型差異進(jìn)行相關(guān)研究。

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