張婷　黃青松　范雪暉

摘要：通過(guò)克隆獲得泛醌-細(xì)胞色素C還原酶鐵硫蛋白亞基1（Ubiquinol-cytochrome C reductase iron-sulfur subunit 1，UQCRFS1）基因，對(duì)基因序列及其編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，研究了其在大鼠（Rattus norvegicus）心、腦、腎、肺組織中的表達(dá)模式。測(cè)序結(jié)果顯示UQCRFS1基因全長(zhǎng)826 bp，RT-PCR結(jié)果顯示其在大鼠心臟中表達(dá)量較高，腦和肺中表達(dá)量稍低，腎臟組織中表達(dá)量最低，推測(cè)UQCRFS1的功能可能與大鼠的心臟發(fā)育有關(guān)。

關(guān)鍵詞：大鼠（Rattus norvegicus）；UQCRFS1基因；克隆；表達(dá)模式

中圖分類(lèi)號(hào)：Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）09-2174-03

鐵硫蛋白作為電子載體在生命活動(dòng)中起著重要的作用，其特征是存在著鐵硫簇，常見(jiàn)的鐵硫簇中含2、3或4個(gè)鐵原子，這些鐵原子與多肽鏈相連，并由無(wú)機(jī)硫進(jìn)行聯(lián)結(jié)，由簡(jiǎn)單的鐵硫簇通過(guò)金屬聯(lián)結(jié)組裝成更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)[1-4]，鐵硫蛋白正是基于鐵硫簇而具有優(yōu)異的電子傳遞功能。主要的鐵硫蛋白包括細(xì)菌和線粒體呼吸鏈中的復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，光合作用中的光系統(tǒng)Ⅰ和鐵氧還原蛋白，氮養(yǎng)菌中的固氮酶，Krebs循環(huán)中的順烏頭酸酶，以及哺乳動(dòng)物中對(duì)鐵的吸收起調(diào)控作用的鐵調(diào)控蛋白Ⅰ等[5，6]。參與鐵硫簇合成的關(guān)鍵蛋白已經(jīng)被確定，但對(duì)其分子水平上的機(jī)制及如何進(jìn)行相互作用在機(jī)體內(nèi)外合成鐵硫蛋白尚待進(jìn)一步研究[7-9]。泛醌-細(xì)胞色素C還原酶鐵硫蛋白亞基1（Ubiquinol-cytochrome C reductase iron-sulfur subunit 1，UQCRFS1）是線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅲ中的一個(gè)亞單位，廣泛分布在生物體中。目前對(duì)UQCRFS1基因的研究主要集中于阿爾茨海默病、心肌收縮疾病、亨廷頓舞蹈病、帕金森等相關(guān)疾病上。本研究根據(jù)前期工作所得的差異性片段，進(jìn)行生物信息學(xué)分析后設(shè)計(jì)出特異性引物，克隆出大鼠（Rattus norvegicus）UQCRFS1基因的全長(zhǎng)，進(jìn)而研究該基因在大鼠心、腦、肺、腎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)動(dòng)態(tài)，為探討其在大鼠發(fā)育過(guò)程中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

健康SD純系大鼠，雌雄不限，購(gòu)自新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。分別取1日齡、10日齡、20日齡健康SD大鼠的心、腦、肺、腎組織用作基因表達(dá)譜分析。Taq DNA聚合酶、pGEM-T Easy載體和DNA回收試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas公司，PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

2 結(jié)果與分析

2.1 UQCRFS1基因的克隆

2.1.2 UQCRFS1基因的序列測(cè)定結(jié)果 采用DNA回收試劑盒回收并純化擴(kuò)增得到的UQCRFS1基因，連接pGEM-T Easy載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選陽(yáng)性菌落提取質(zhì)粒，對(duì)UQCRFS1基因測(cè)序，所得結(jié)果見(jiàn)圖2。UQCRFS1基因全長(zhǎng)826 bp，編碼274個(gè)氨基酸。

2.2 UQCRFS1基因的表達(dá)模式分析

3 小結(jié)與討論

不同結(jié)構(gòu)的鐵硫蛋白具有不同的生物學(xué)功能，主要包括參與電子傳遞、底物的結(jié)合與激活、鐵/硫的存儲(chǔ)、基因表達(dá)的調(diào)控、酶活力的調(diào)控等[10，11]。本研究克隆得到UQCRFS1基因，并根據(jù)測(cè)序結(jié)果得到其編碼的氨基酸序列，利用相關(guān)的預(yù)測(cè)軟件對(duì)該蛋白進(jìn)行了結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)方面的分析。結(jié)果顯示，UQCRFS1含有274個(gè)氨基酸殘基，推測(cè)其分子式為C1306H2088N366O390S9，不穩(wěn)定指數(shù)為46.87，表明其三維結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。預(yù)測(cè)UQCRFS1在哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞中的半衰期為30 h，在酵母中的半衰期為20 h以上，在大腸桿菌中的半衰期為10 h以上。

對(duì)UQCRFS1基因在大鼠心、腦、肺、腎各組織中的表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果表明該基因在心臟組織中表達(dá)量較高，腦和肺組織中表達(dá)量稍低，腎臟組織中表達(dá)量最低，同時(shí)發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)水平隨組織的發(fā)育有上升趨勢(shì)。可見(jiàn)UQCRFS1與大鼠心臟發(fā)育有關(guān)，但其在大鼠發(fā)育過(guò)程中的作用機(jī)制還不清楚，有待進(jìn)一步的研究。

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