李會 任志瑩 王穎 王建忠

摘要：比較3種不同DNA提取試劑盒（寶生物、天根、LGC）在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測中的應(yīng)用效果，分別提取玉米、水稻和大豆種子的基因組DNA。結(jié)果表明，天根DNA提取試劑盒DP305更為適合從作物種子中提取基因組DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分檢測。

關(guān)鍵詞：DNA提取試劑盒；基因組DNA；作物；比較

中圖分類號：Q943.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）08-1956-03

隨著轉(zhuǎn)基因作物種類的增多和種植面積的增加[1]，轉(zhuǎn)基因種子的應(yīng)用越來越廣泛。轉(zhuǎn)基因技術(shù)在提高作物產(chǎn)量、改善作物品質(zhì)、緩解糧食危機(jī)等方面作出了巨大貢獻(xiàn)，然而其安全性方面的不確定因素也帶來了轉(zhuǎn)基因生物安全問題[2，3]。2001年發(fā)布實(shí)施了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》，對農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品實(shí)行安全評價制度、生產(chǎn)許可制度、經(jīng)營許可制度和產(chǎn)品標(biāo)識制度[4，5]。因此，需要對作物種子進(jìn)行轉(zhuǎn)基因檢測，而基因組DNA提取作為轉(zhuǎn)基因檢測中的關(guān)鍵步驟，需要穩(wěn)定、重復(fù)性好、簡便快捷的方法進(jìn)行提取?；蚪MDNA提取的方法有很多[6-8]，目前廣泛使用的是商業(yè)化的基因組DNA提取試劑盒[9]，常見的DNA提取試劑盒主要分為3類：離心柱型、無毒型（不使用酚氯仿）、磁珠型。

本研究使用常見的不同DNA提取試劑盒對玉米、水稻、大豆種子的基因組DNA提取效果進(jìn)行比較，確定了適合轉(zhuǎn)基因檢測使用的DNA提取試劑盒。

1 材料和方法

1.1 材料

轉(zhuǎn)基因玉米MON810、轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號、轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2均為農(nóng)業(yè)部發(fā)放的標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2 試劑與儀器

天根DP305 DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，寶生物D9093 DNA提取試劑盒購自沈陽聯(lián)星生物技術(shù)公司，LGC41602 DNA提取試劑盒購自北京昊諾斯科技有限公司，PCR反應(yīng)試劑均購自寶生物工程（大連）有限公司。

5424型高速離心機(jī)購自德國Eppendorf公司，ND2000型DNA定量儀購自美國Thermo公司，C1000型PCR儀及GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司，BG-600k核酸水平電泳系統(tǒng)購自北京百晶生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 轉(zhuǎn)基因作物基因組DNA的提取 使用3種DNA提取試劑盒分別提取轉(zhuǎn)基因玉米MON810、轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號和轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的基因組DNA，操作方法具體見試劑盒說明書。測定其DNA濃度及OD260 nm/OD280 nm。DNA提取率（μg/g）=DNA濃度（ng/μL）×體積（μL）/取材量（g）[5]。

1.3.2 PCR擴(kuò)增驗(yàn)證 通過擴(kuò)增篩選因子CaMV35S啟動子基因來檢測3種DNA試劑盒提取的基因組DNA在轉(zhuǎn)基因成分檢測中的效果，試驗(yàn)重復(fù)3次。PCR擴(kuò)增引物和擴(kuò)增條件[10]見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種DNA提取試劑盒提取基因組DNA的效果比較結(jié)果

3種DNA試劑盒所提取的DNA及相關(guān)結(jié)果見表2。從表2中可以看出，LGC DNA試劑盒提取率最高，成本最高；寶生物試劑盒提取率次之，提取時間也較長，成本也較高；天根試劑盒提取率最低，成本也最低。在操作過程中還發(fā)現(xiàn)，LGC試劑盒和寶生物試劑盒的操作步驟比較繁瑣，天根試劑盒的操作最簡便快捷。

3種DNA提取試劑盒提取的基因組DNA濃度和純度比較見圖1和圖2。從圖1中可以看出，無論是玉米、水稻還是大豆，LGC試劑盒提取的DNA濃度為最高，寶生物和天根試劑盒提取的玉米和水稻的DNA濃度比較接近，但提取的大豆DNA濃度有明顯差異，天根試劑盒提取的較低。從圖2中可以看出，就大豆而言，天根試劑盒提取DNA純度最高，寶生物試劑盒提取的次之，LGC試劑盒提取的最低；就玉米而言，LGC試劑盒提取的DNA純度最高，寶生物試劑盒提取DNA純度次之，天根試劑盒提取的最低；就水稻而言，LGC試劑盒提取的DNA純度最高，天根試劑盒提取DNA純度次之，寶生物試劑盒提取的最低。

2.2 3種DNA試劑盒提取基因組DNA的PCR驗(yàn)證結(jié)果分析

使用3種DNA試劑盒分別提取的玉米、水稻、大豆種子的基因組DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增CaMV35S啟動子基因結(jié)果如圖3。從圖3中可以看出，在均取1 μL DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)的情況下，PCR反應(yīng)擴(kuò)增CaMV35S啟動子來檢測提取的DNA，寶生物和天根試劑盒的圖譜較清晰，LGC試劑盒效果較差。

3 小結(jié)與討論

天根試劑盒采用的是離心柱法，DNA損耗量較大，但是對于日常檢測提取的樣品是足夠使用的。由于其對樣品需求量小、耗時短、操作簡單、成本低、純度好，在日常檢測中應(yīng)用較廣。寶生物試劑盒在樣品使用量上較大，水浴時間也較長，操作步驟較天根試劑盒更為繁瑣一些。英國LGC類型屬于磁珠型，試劑盒內(nèi)包含一個小的磁力架（可放置2個1.5 mL離心管），過程中不使用酚和氯仿，操作中不需要高速離心，提取的DNA濃度較高，但成本也較高。綜上所述，天根DNA提取試劑盒DP305較適合從作物種子中提取基因組DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分檢測。

參考文獻(xiàn)：

[1] JAMES C. 2009 年全球生物技術(shù)/轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢——第一個十四年（1996-2009）[J].中國生物工程雜志，2010，30（2）：1-22.

[2] 周萍入， 齊振宏. 消費(fèi)者對轉(zhuǎn)基因食品健康風(fēng)險與生態(tài)風(fēng)險認(rèn)知實(shí)證研究[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（社會科學(xué)版），2012（1）：5-10.

[3] 王桂才. 轉(zhuǎn)基因食品的安全性評價及檢測技術(shù)進(jìn)展[J]. 食品研究與開發(fā)，2012，33（5）：220-221.

[4] 宋貴文，李飛武，張 明，等.我國農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全檢測機(jī)構(gòu)體系運(yùn)行現(xiàn)狀分析[J].農(nóng)業(yè)科技管理，2011，30（1）：40-43.

[5] 王明遠(yuǎn). 轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管模式及我國轉(zhuǎn)基因生物安全立法研究[J]. 上海交通大學(xué)學(xué)報（農(nóng)業(yè)科學(xué)版），2007，25（2）：169-172.

[6] GB/T 19495.3-2004，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測 核酸提取純化方法[S].

[7] ZHANG F L， LIU Y， SONG J， et al. A method for rapid salt-extraction of high-quality genomic DNA from plant seeds[J]. Agricultural Science & Technology-Hunan，2012，13（3）：485-488.

[8] 莊 蓉，郭瓊霞，黃可輝，等.菟絲子屬5個種的種子DNA微量提取方法比較[J].植物檢疫，2008，22（4）：216-219.

[9] 趙梅珍，劉 暉，賀莉芳，等.三種試劑盒提取糞便隱孢子蟲微量 DNA 的效果比較[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（26）：16130-16131.

[10] 農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，上海交通大學(xué)，等.農(nóng)業(yè)部953號公告-6-2007轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測抗蟲轉(zhuǎn)Bt基因水稻定性PCR方法[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2007.1-6.