劉勝利 王友杰 馮黎 馬素珍 侯俊林 伍盼盼

【摘 要】目的：探討慢性憤怒應激對D-半乳糖（D-gal）大鼠抗氧化功能的影響。方法：在D-gal衰老及腦老化模型基礎上引入憤怒刺激，用Morris水迷宮實驗觀察慢性憤怒應激對大鼠空間學習記憶能力的影響，并測定血漿中丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）的含量。結(jié)果：與模型組比較，憤怒應激組大鼠空間學習記憶能力明顯下降；憤怒應激組大鼠血漿MDA升高，SOD降低。結(jié)論：慢性憤怒應激加重D-gal大鼠氧化反應，減弱抗氧化能力，降低空間學習記憶能力，加速腦老化進程。

【關(guān)鍵詞】憤怒；應激；腦老化；抗氧化功能

隨著生活節(jié)奏加快，社會競爭日趨激烈，情緒沖突和心理應激逐漸增多。研究發(fā)現(xiàn)，心理應激嚴重危害人類身心健康，使機體衰老過程加速，學習記憶能力下降。怒乃五志之一，又是負性情緒的核心[1]，許多重大的身心疾病都可以追溯到憤怒情緒的調(diào)節(jié)不良，臨床上也較常見到，長期憤憤不平的個體較易出現(xiàn)學習記憶能力的衰退。中醫(yī)基礎理論認為，肝主疏泄，在志為怒，怒傷肝，長期或劇烈的憤怒情緒會阻礙肝疏泄氣機的功能，使氣機逆亂。頭為諸陽之會，五臟精華之血，六腑清陽之氣皆匯聚于腦，方有神明之用，若氣機逆亂，氣血不能正常輸布于腦，腦失濡養(yǎng)則腦老化加速。因此可以推論，憤怒情緒的長期積累是腦老化加速的重要原因之一。本論文借助Morris水迷宮設備和氧化、抗氧化指標，探討慢性憤怒應激對D-gal大鼠衰老及腦老化程度的影響，以驗證這一推斷。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 Wistar雄性大鼠56只，SPF級3月齡，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司（SCXK（京）2006-0009），體重為360±10g。在河南省食品藥品檢驗所動物實驗中心屏障環(huán)境設施動物實驗室（SYXK（豫）2005-0011）進行實驗，并由該實驗室提供標準實驗動物滅菌飼料。正常飼養(yǎng)3日后，按體重隨機分為空白對照組、D-gal衰老及腦老化模型組（簡稱模型組）、慢性憤怒應激組（簡稱憤怒應激組）三組，每組14只，其余14只作為攻擊鼠。各組分籠飼養(yǎng)，自由飲食飲水。（注：模型組予以注射D-gal，憤怒應激組在注射D-gal基礎上引入憤怒刺激。）

1.2 主要試劑及儀器 MDA測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20091126）；SOD測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20091126）；F-4500熒光分光光度計（日本日立）；HPS-250生化培養(yǎng)箱（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；Morris水迷宮（自制）。

1.3 D-gal衰老模型 參考李文彬等[2] D-gal衰老及腦老化造模方法，模型組和憤怒應激組注射D-gal溶液，制作衰老及腦老化模型。具體方法：將D-gal溶于生理鹽水，濃度為2%，注射容量為0.01ml·g-1，每日1次，頸后部皮下注射，空白對照組注射同體積生理鹽水，連續(xù)6周。每周測體重1次，依所測體重計算注射容量。

1.4 憤怒應激組引入憤怒刺激的方法 課題組在夾尾間接激怒法[2]基礎上，受傳統(tǒng)直接電擊法的啟發(fā)，創(chuàng)立一種新型誘發(fā)大鼠憤怒情緒的方法——間接電擊激怒法。自實驗第三周始每天下午3點對憤怒應激組大鼠進行憤怒刺激。具體方法：使用特制電刺激儀作為電刺激工具，把憤怒應激組大鼠單獨放入特制金屬籠內(nèi)，再隨機放進一只攻擊鼠，用一端電極觸碰攻擊鼠（電極的另一端與金屬籠相連以構(gòu)成回路），攻擊鼠受電擊被激惹，對憤怒應激組大鼠發(fā)起攻擊，雙方互相撕咬、對峙，產(chǎn)生憤怒心理和行為，頻率為1-2次/min，每天刺激時間為15min，連續(xù)4周。最后攻擊鼠丟棄不用。

1.5 標本采集及制備 實驗至第37天始，進行Morris水迷宮測試，為期6天。至第42天完成實驗后，禁食24小時，按每100g體重注射0.5-1.5ml 20%烏拉坦，麻醉后經(jīng)腹主動脈取血4～5ml，靜置、離心，吸取上清液，-70℃保存，用于測定血漿MDA、SOD。

1.6 6.統(tǒng)計學方法 實驗結(jié)果用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進行處理。數(shù)值變量以 進行統(tǒng)計描述。數(shù)值變量組間均數(shù)差異的比較，正態(tài)分布和方差符合齊性

檢驗后，采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較用LSD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 慢性憤怒應激對D-gal大鼠空間學習記憶能力的影響 表1顯示的是Morris水迷宮第6天的測試結(jié)果：憤怒應激組較模型組大鼠尋臺時間（SPL）明顯延長（P<0.05）。見表1。

2.2.慢性憤怒應激對D-gal大鼠血漿MDA、SOD的影響 與模型組相比，憤怒應激組大鼠血漿MDA含量明顯升高（P<0.05），SOD含量明顯降低（P<0.05）。見表1。

3 討論

學習記憶能力減退是衰老尤其是腦老化的重要表現(xiàn)。本研究用Morris水迷宮法檢測動物空間定位與學習記憶能力，結(jié)果顯示：憤怒應激組較模型組SPL明顯延長，提示持續(xù)的憤怒應激加重D-gal衰老大鼠空間學習能力減退的程度，加速大鼠腦老化進程。

在引起衰老的學說中，自由基學說占有一席之地，該學說認為自由基會對細胞內(nèi)生物大分子產(chǎn)生氧化損傷，損傷的累積可逐漸引起細胞功能的衰退，導致機體衰老。MDA是自由基損傷不飽和脂肪酸生成的脂類過氧化分解產(chǎn)物，MDA含量的升高可以證明自由基水平升高及反映機體氧化損傷程度加重[3]；SOD是一種含有銅、鋅、鐵、錳的新型金屬酶制劑，廣泛存在與生物體內(nèi)，是機體對抗自由基的第一道防線。許多報道表明，SOD活性隨年齡增長而降低，其活性與物種的壽命呈正相關(guān)，它在保護腦功能、延緩衰老方面發(fā)揮著重要作用[4]。

本項研究觀察了大鼠血漿MDA含量變化，結(jié)果顯示：與空白對照組相比，模型組和憤怒應激組大鼠血漿MDA含量均明顯上升，且憤怒應激組比模型組上升更為顯著。提示憤怒應激可在D-gal引起衰老的基礎上，進一步加重機體脂質(zhì)過氧化反應。同時，與空白對照組相比，模型組與憤怒應激組血漿SOD活性均明顯下降，且憤怒應激組比模型組下降更為明顯。提示慢性憤怒應激可在D-gal引起衰老的基礎上進一步降低機體抗氧化能力。

綜上所述，慢性憤怒應激增加血漿MDA含量，降低大鼠血漿SOD活性，即導致了大鼠抗氧化功能下降，同時根據(jù)Morris水迷宮實驗數(shù)據(jù)，憤怒應激組大鼠空間學習記憶能力下降，表明長期憤怒應激使大鼠氣血不能正常輸布，腦失濡養(yǎng)導致腦老化進程加速。

參考文獻：

[1] 詹向紅，李偉，徐瑋瑋等.慢性憤怒應激對衰老大鼠學習記憶能力的影響及其脂質(zhì)過氧化機制.中國老年學雜志[J].2010，30（6）：752-753.

[2] 李文彬.D-半乳糖衰老和腦老化模型研究.見：陳可冀，李春生.新編抗衰老中藥學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1998：153-162.

[3] Nohl H. Involvement of reeradi calsinageing： a consequence on cause of senescence [J]. Bri Med Bull， 1993， 49（30）：653-657.

[4] 孟凡星，高維娟，袁國紅，等.益腎降濁湯對大鼠腦缺血再灌注SOD活性和MDA含量的影響[J].承德醫(yī)學院學報，2001，18（1）：7-8.