廖勇等

摘 要：以草魚幼魚為研究對象，用半致死濃度的嗜水氣單胞菌感染魚體，然后取病魚和對照組的肝、脾、腎經(jīng)Bouins液固定，石蠟包埋、切片、H.E染色，Nikon顯微鏡觀察照相。結(jié)果表明：經(jīng)過感染的魚體肝、脾、腎都出現(xiàn)不同程度的腫大，肝臟灰白色，脾臟暗紫色。切片觀察發(fā)現(xiàn)肝臟實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞明顯，肝血管內(nèi)血細(xì)胞減少，肝細(xì)胞腫脹、渾濁，空泡化；腎臟間質(zhì)比例增大，腎小管和腎小體數(shù)量明顯減少，腎小管上皮細(xì)胞腫脹、變性；脾臟內(nèi)大量充血，脾臟淋巴細(xì)胞壞死，H.E染色發(fā)現(xiàn)大量的棕色“小結(jié)”充斥于整個(gè)脾臟之中。

關(guān)鍵詞：嗜水氣單胞菌；草魚幼魚；肝臟；脾臟；腎臟

中圖分類號 S965.112 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 B 文章編號 1007-7731（2013）06-17-04

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）廣泛存在于自然界中受污染的水域及土壤，可分為致病性菌株和非致病性菌株。致病性菌株可感染魚類等脊椎動(dòng)物，臨床上以急性出血性敗血癥為主要特征。慢性感染表現(xiàn)為皮膚潰瘍或腸炎[1]。人感染后會(huì)發(fā)生腹瀉或食物中毒，是一種典型人—獸—魚共患病病原菌[2]，可直接影響人類的健康，給養(yǎng)殖業(yè)帶來重大經(jīng)濟(jì)損失。

草魚（Ctenopharyngodon idellus）屬鯉形目鯉科雅羅魚亞科草魚屬。因其生長快，飼料來源廣，是深受群眾喜愛的四大家魚之一。研究嗜水氣單胞菌對草魚幼魚肝、腎、脾的影響，可以為漁業(yè)生產(chǎn)、魚病防治和診斷提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)魚選購于農(nóng)貿(mào)市場，1齡健康草魚種60尾。體重在34～66g，體長125～168mm，全長150～187mm。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 將購回的草魚種放在34cm×21cm×25cm的玻璃缸中馴養(yǎng)，每天投喂少量飼料和定時(shí)換水。1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2.1 菌液制備 （1）菌液來源：菌液來源于西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；（2）菌種計(jì)數(shù)：將菌液稀釋4倍與標(biāo)準(zhǔn)比濁管比濁計(jì)數(shù)，利用比濁計(jì)數(shù)法計(jì)算菌液濃度。

1.2.2 半致死濃度測定 （1）將40尾魚隨機(jī)分為4個(gè)實(shí)驗(yàn)組、1個(gè)對照組，每組8尾，分別喂養(yǎng)在34cm×21cm×25㎝的玻璃缸中。將水溫維持在（25±1）℃。（2）將制備好的菌液分別用魚用生理鹽水稀釋至109（組1）、108（組2）、107（組3）、106（組4）數(shù)量級濃度的菌液，然后每個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別在背鰭基部注射相應(yīng)濃度的菌液0.2mL。對照組（組5）注射魚用生理鹽水0.2mL。（3）觀察魚的活動(dòng)狀況，確定半致死濃度。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 將健康的16尾魚分為1個(gè)實(shí)驗(yàn)組、1個(gè)對照組，每組8尾。實(shí)驗(yàn)組在背鰭基部注射0.2mL半致死濃度的菌液，對照組背鰭基部注射0.2mL生理鹽水。從外形和活動(dòng)狀態(tài)觀察，取染病初期和瀕死個(gè)體的肝、脾、腎組織，及對照組草魚肝、脾、腎組織用Bouins液固定，經(jīng)石蠟包埋、切片、H.E染色，Nikon顯微鏡觀察照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌液計(jì)數(shù) 利用比濁計(jì)數(shù)法，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=28.453x-1.304 9（y為溶液濃度，x為溶液吸光度）。測得稀釋4倍的菌液吸光度為0.436，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到原嗜水氣單胞菌液濃度為y=（28.453×0.436-1.304 9）×4cfu/mL，即4.44×109cfu/mL。

2.2 半致死濃度測定

2.2.1 病魚癥狀 從外觀上看，可見病魚潰瘍、腹水、敗血等癥狀，接種初期出現(xiàn)紅腫，鱗片無光澤，松動(dòng)易脫落，繼而肌肉組織溶解，且有液體滲出，皮膚向外隆起，有的在注射部位對側(cè)也出現(xiàn)相應(yīng)癥狀。瀕死魚注射部位皮膚、肌肉糜爛壞死，形成以潰瘍和穿孔為特征的病變部位。感染魚背部、腹鰭根部及眼睛有充血現(xiàn)象，剖開魚腹腔，可見渾濁紅色腹水流出，腥臭異味。肝、脾、腎腫大，肝臟呈灰白色，脾臟暗紫色，脾臟與相鄰臟器相粘連，難以分離。

2.2.2 半致死濃度確定 人工感染實(shí)驗(yàn)總共進(jìn)行了7d，前4d觀察各實(shí)驗(yàn)組都出現(xiàn)魚體背鰭基部紅腫、魚體游動(dòng)緩慢等癥狀。實(shí)驗(yàn)組1 5d中死亡5尾，實(shí)驗(yàn)組2 7d死亡2尾，其它組在4～5d后患病魚體紅腫部位逐漸消失，病情好轉(zhuǎn)，這可能是由于草魚對嗜水氣單胞菌具有天然抗性有關(guān)。實(shí)驗(yàn)過程中，注射了生理鹽水的對照組魚體外觀特征無明顯變化。根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，求得嗜水氣單胞菌的半致死濃度為3.11×109cfu/mL。整個(gè)實(shí)驗(yàn)魚體死亡情況見表1。

2.3 病魚的組織切片觀察

2.3.1 肝臟組織病理變化 正常、健康魚肝臟的間質(zhì)較少，肝小葉分界不明顯，小葉外周的血竇常匯合成網(wǎng)，近小葉中心呈輻射排列；肝細(xì)胞圓形或略呈橢圓形，細(xì)胞排列緊密，肝血管內(nèi)充滿血細(xì)胞（圖1）。染病的魚肝臟外觀顏色暗淡，略微腫大。從組織切片上看，較難分清肝臟的實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)（圖2）。肝細(xì)胞渾濁、腫脹，染病較重時(shí)，可見細(xì)胞核腫脹、空泡化、碎裂（圖3）。病情嚴(yán)重時(shí)，大量肝細(xì)胞壞死、解體、胞質(zhì)溢出，成淺紅色一片。血細(xì)胞數(shù)量明顯減少，肝細(xì)胞間有少量血細(xì)胞。

3 小結(jié)與討論

20世紀(jì)70年代初，嗜水氣單胞菌作為一種人類腸道病原菌，給人類健康帶來危害，如導(dǎo)致人體急性腹瀉，傷口感染現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生；與其他菌一起引起人的膽囊炎、腹膜炎、腦膜炎、肺炎和體外創(chuàng)傷感染等；淡水魚感染后，常表現(xiàn)為皮膚潰瘍的慢性型病等，或是敗血癥急性死亡。如常見病有白鰱的“打印病”[3-4]，鯉魚的紅斑病、豎鱗病[5]，中華鱉的穿孔病、紅脖子病[6-7]，異育銀鯽的溶血性腹水病等[8-9]。

人工注射嗜水氣單胞菌的病理變化主要表現(xiàn)為局部組織細(xì)胞的變性與壞死。病魚發(fā)病初期，通常表現(xiàn)為注射部位的紅腫充血。病原菌通過血液循環(huán)進(jìn)入肝臟，使肝組織嚴(yán)重變性、壞死，機(jī)體的抵抗力迅速下降，繼而病毒繼續(xù)入侵，最終導(dǎo)致魚體死亡。

組織切片觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病魚肝、脾、腎均有不同程度的病理變化，如細(xì)胞腫脹、變性及壞死。肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)模糊，實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)受損，中央靜脈和肝血竇普遍缺血，肝細(xì)胞空泡化嚴(yán)重等。腎間質(zhì)比例增大，腎小管上皮細(xì)胞腫脹，腎小體和腎小管數(shù)量明顯減少，管腔界限不清，出現(xiàn)輕微的空泡變性。脾臟腫脹明顯，組織大量出血，H.E染色觀察可見大量的棕黃色“小結(jié)”現(xiàn)象。這些特征與杜雄偉等[10]研究的嗜水氣單胞菌感染劍尾魚造成的肝、脾、腎的病理變化相似，這表明嗜水氣單胞菌對不同魚體的組織病理學(xué)感染具有相似性。但與米瑞芙等[11]對白鰱出血性敗血癥研究有差異，這表明嗜水氣單胞菌對不同的魚類損傷也是有差異的，也可能是由于不同魚體對病菌的入侵抵抗力不同有關(guān)。

在觀察病變組織時(shí)，發(fā)現(xiàn)染病魚體的肝、腎、脾中均存在棕黃色的“小結(jié)”，且以脾臟中較多。王鐵輝等[12]對稀有鮈鯽出血病的研究認(rèn)為，在脾臟中出現(xiàn)的大量棕色“小結(jié)”可能是衰老的紅血球。因脾臟是魚體的造血和滅血器官，血竇中有紅血球和巨噬細(xì)胞等。正常脾臟中巨噬細(xì)胞可以吞噬衰老的紅細(xì)胞，分解血紅蛋白后便可形成棕色“小結(jié)”。而當(dāng)病魚脾臟組織受損時(shí)，巨噬細(xì)胞便聚集在一起，吞噬紅細(xì)胞并分解血紅蛋白形成棕色的“小結(jié)”。因此在病魚脾臟中會(huì)出現(xiàn)棕色“小結(jié)”增多的現(xiàn)象。

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（責(zé)編：徐世紅）