劉乃芝，陳 靜，徐 輝，閆福海，谷 巍

（山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司，山東 泰安 271000）

隨著我國(guó)畜牧業(yè)生產(chǎn)規(guī)?；?、集約化程度的不斷發(fā)展，畜禽產(chǎn)生的大量糞尿和有毒有害氣體（例如NH3、H2S、CH4、吲哚、糞臭素等）對(duì)環(huán)境的污染不斷加劇[1-3]。不僅對(duì)人類(lèi)的健康造成極大的威脅，而且嚴(yán)重影響著畜禽健康和生產(chǎn)性能的發(fā)揮[4-8]。隨著公眾環(huán)境意識(shí)的進(jìn)一步增強(qiáng)，畜禽業(yè)對(duì)于環(huán)境的污染也面臨著很大的壓力；對(duì)畜禽糞污的處理國(guó)內(nèi)外已研究出許多方法，除了通過(guò)合理的營(yíng)養(yǎng)配方、科學(xué)的畜牧場(chǎng)規(guī)劃設(shè)計(jì)和飼養(yǎng)管理以外，近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的微生物處理方法更是研究熱點(diǎn)。微生物除臭即利用微生物進(jìn)行除臭，因具有除臭效率高、無(wú)二次污染、所需設(shè)備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，成為當(dāng)前研究的主要方向[9-14]。研究發(fā)現(xiàn)，NH3揮發(fā)量與糞便中其他致臭物質(zhì)揮發(fā)高度相關(guān)（R=0.94），減少NH3揮發(fā)，可減少糞便惡臭[15]。氨氣濃度的高低常作為衡量養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境空氣好壞的重要指標(biāo)之一[16]。因此，篩選高效的氨同化微生物，進(jìn)行生物脫臭，是控制養(yǎng)殖場(chǎng)惡臭的一個(gè)重要研究方向。本研究是在前人研究的基礎(chǔ)上，對(duì)本研究室前期土壤和污水中分離的百余株芽孢菌進(jìn)行氨氮降解菌的篩選，以期獲得降氨、除臭效果最佳的芽孢桿菌，并對(duì)其效果進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌種：由寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司生物研究院提供芽孢桿菌127株。

芽孢桿菌培養(yǎng)基：葡萄糖0.2%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，酵母膏0.5%，pH 7.0。

紫色石蕊的配制：在250mL的燒杯中注入蒸餾水150mL，加入半藥匙石蕊粉末，微熱至50～60℃，攪動(dòng)加速溶解形成深藍(lán)紫色溶液，即原液，備用。不斷攪拌的條件下，在藍(lán)紫色石蕊原液中逐滴加入極稀的磷酸溶液，直到溶液變紫為止。若磷酸溶液稍過(guò)量，則會(huì)調(diào)成紅色石蕊。

BTB溶液：1%溴百里酚藍(lán)的酒精溶液。

氮素-限制性培養(yǎng)基：葡萄糖2.5 g，NH4Cl 0.125 g，NaCl 0.25 g，MgSO4· 7H2O 0.25 g，Mn-Cl2· 4H2O 0.05 g，K2HPO40.5 g，KH2PO41.6 g，1%ZnSO42mL，CoCl20.002 g，用0.45μm濾膜除菌，pH 7.0～7.2。

抑氨菌富集培養(yǎng)液:（NH4）2SO42.0 g，K2HPO41.0 g，MgSO4· 7H2O 0.5 g，CaCO35.0 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.4 g，NaCl 2.0 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.2， 1×105Pa滅菌20min[15]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 降氨菌的初篩

將芽孢菌127株分別接種到含50mL無(wú)菌芽孢桿菌液體培養(yǎng)基中，37℃、180 rpm搖床培養(yǎng)24 h制備成種子液，在無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)用滅菌槍頭吸取少量種子液，點(diǎn)在含有紫色石蕊的氮素-限制性平板培養(yǎng)基上，37℃條件下培養(yǎng)24 h后，在此平板培養(yǎng)基上均勻地覆蓋上BTB溶液，觀察菌落及其周?chē)娜旧h(huán)，并測(cè)定其直徑大小。根據(jù)式（1）評(píng)定微生物利用氨的強(qiáng)弱。

其中D為菌環(huán)的平均直徑（cm），d為菌落的平均直徑（cm）。平均直徑（cm）＝（縱向直徑＋橫向直徑）/2，直徑測(cè)量值精確到0.01 cm[14]。

1.2.2 降氨菌的復(fù)篩

抑氨菌的篩選：將種子液按2%的接種量接入裝有100mL抑氨菌富集培養(yǎng)基的三角瓶中（同時(shí)設(shè)兩個(gè)對(duì)照，分別為加入等量的培養(yǎng)基和無(wú)菌水），每組兩個(gè)重復(fù)，37℃，180 rpm搖床培養(yǎng)15 d，每隔3 d檢測(cè)1次培養(yǎng)基中的氨氮含量，檢測(cè)前在無(wú)菌超凈臺(tái)中取樣，5 000 rpm離心10min，上清液采用納氏比色法進(jìn)行氨氮含量的檢測(cè)。

1.2.3 對(duì)糞便中氨氮的降低效果試驗(yàn)

將復(fù)篩過(guò)程中氨氮去除率＞20%的菌株進(jìn)行糞便中氨氮的降低效果試驗(yàn)。將各菌株以2%接種量（對(duì)照組為等量無(wú)菌水）添加入裝有100 g新鮮雞糞的三角瓶中，每菌株2個(gè)平行，攪拌均勻，并在三角瓶中吊入裝有20mL 2%硼酸吸收液的50mL三角瓶，放置于室溫并密封，每隔24 h取出各組盛有硼酸吸收液的三角瓶，以0.010 68mol·L-1硫酸溶液進(jìn)行滴定，指示劑為溴甲酚綠-甲基紅指示液，滴定過(guò)程中以溶液顏色由藍(lán)綠色變成灰紫色為終點(diǎn)。各組取出硼酸吸收液后敞口1 h，之后再放入等量硼酸并重新密封，共測(cè)定4 d，計(jì)算氨氮濃度及氨氮去除率，其計(jì)算式見(jiàn)式2～3[15]。

式中c為滴定用硫酸溶液的物質(zhì)的量濃度，mg·L-1；v為滴定各組硼酸吸收液消耗硫酸溶液體積的平均值，mL；14為氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，g·mol-1；V為2%硼酸吸收液體積，mL。

式中，c為滴定用硫酸溶液物質(zhì)的量濃度，mol·L-1；v0為滴定對(duì)照組消耗硫酸溶液體積的平均值，mL；v為滴定菌株純培養(yǎng)液消耗硫酸溶液體積的平均值，mL；14為氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，g·mol-1；V為硼酸吸收液體積，mL。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以平均值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 降氨菌的篩選

菌種資源中心提供的127株芽孢菌，經(jīng)過(guò)初步篩選之后，有89株芽孢桿菌菌落周?chē)纬牲S色暈環(huán)。其原因?yàn)檠挎邨U菌接種到氮素限制性鑒別平板培養(yǎng)基上之后，隨著芽孢桿菌對(duì)氨同化的進(jìn)行，培養(yǎng)基中的含氮成分逐漸減少，并被消耗掉，菌落周?chē)膒H逐步降低，進(jìn)而使培養(yǎng)基與添加的溴百里酚藍(lán)指示劑發(fā)生顯色反應(yīng)，在菌落周?chē)纬牲S色環(huán)。由于菌落形態(tài)不規(guī)則，因此菌落周?chē)臅灜h(huán)無(wú)法精確測(cè)量，通過(guò)大批量試驗(yàn)結(jié)果總結(jié)發(fā)現(xiàn)，只要菌株能在此培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，就可在菌落周?chē)?jiàn)黃色暈環(huán)，即該菌株可以利用培養(yǎng)基中的氨氮。通過(guò)對(duì)89株芽孢桿菌在抑氨富集培養(yǎng)基中的復(fù)篩，得到與對(duì)照組相比氨氮清除率＞20%的有6株，氨氮清除率＞20%的菌株見(jiàn)表1。

表1 氨氮清除率＞20%的菌株

2.2 對(duì)糞便中氨氮的降低效果試驗(yàn)

將前期篩選出的氨氮降解率＞20%的6株芽孢桿菌進(jìn)行糞便中氨氮降低驗(yàn)證效果試驗(yàn)。各組的氨氮濃度見(jiàn)表2。

表2 各組不同時(shí)段的氨氮濃度mg·L-1

從表2中可以看出，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，各組的氨氮濃度均逐漸增加并趨于穩(wěn)定。本試驗(yàn)中選擇每24 h打開(kāi)各組蓋子敞口1 h，目的是為了增加容器內(nèi)的空氣流通，保證芽孢桿菌及糞便中其他需氧菌的正常生長(zhǎng)活動(dòng)，在準(zhǔn)確收集各組產(chǎn)生氨氮的基礎(chǔ)上，盡量模擬養(yǎng)殖場(chǎng)的自然環(huán)境。

各組不同時(shí)段的氨氮去除率見(jiàn)附圖。

附圖 各組不同時(shí)段的氨氮去除率

從附圖中可以看出，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，各組的氨氮去除率基本呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，24 h各組的氨氮去除率相對(duì)較高，其中Y-64組的氨氮去除率為33.33%，Y-85組為22.22%。

3 討論

早在20世紀(jì)四五十年代，歐洲等發(fā)達(dá)國(guó)家就進(jìn)行了除臭方法的研究，除臭微生物的篩選工作也于那時(shí)開(kāi)始起步，近幾年也有研究者分離到了效果更好的菌，KIM等分離到一株能將NH3濃度降低98.5%的乳酸桿菌[9]。我國(guó)對(duì)除臭微生物的研究起步較晚，昌艷萍等從新鮮雞糞中分離得到菌株J-3和J-6可將NH3濃度分別降低70.46%和35.05%[12]。陳麗園等分離到的菌株10MG可使NH3濃度降低67.95%[13]。馮健等利用自行分離的3株菌和引進(jìn)的4株菌，進(jìn)行了除臭效果試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)混合菌對(duì)NH3的去除率在67.90%～83.55%[16]。本試驗(yàn)篩選出的Y-64對(duì)糞便中的氨氮降解率在24 h后達(dá)到33.33%，表明Y-64具有較好的降低氨氮的作用，可以考慮將其作為益生菌來(lái)利用。本試驗(yàn)中，盡管經(jīng)復(fù)篩篩選出的6株芽孢菌均具有一定降低糞便中氨氮的能力，但同一菌株氨同化能力在復(fù)篩和對(duì)糞便中氨氮的降解效果試驗(yàn)兩個(gè)階段統(tǒng)計(jì)所得的數(shù)據(jù)不一致，呈現(xiàn)出一定的差異，推測(cè)可能是由于抑氨富集培養(yǎng)基中與糞便環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)成分和菌群間的差異所導(dǎo)致。本試驗(yàn)篩選出的芽孢菌具體生理性能及除臭機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

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