左志晗，鄭津輝，趙海龍，李玉珊

(天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津，300387)

棒狀鏈霉菌可產(chǎn)生多種抗生素，如異青霉素N、去乙酰基先鋒霉素C、頭霉素C、克拉維酸和棒烷類(lèi)衍生物等。其中，克拉維酸本身的抗菌活性很弱，但它具有強(qiáng)力廣譜且不可逆的 β-內(nèi)酰胺酶抑制活性［1］，使其成為臨床上治療耐藥細(xì)菌性疾病的主要方法之一。但我國(guó)長(zhǎng)期以來(lái)使用的克拉維酸復(fù)方制劑主要依靠進(jìn)口產(chǎn)品，究其原因是我國(guó)目前沒(méi)有好的適合于工業(yè)化生產(chǎn)的克拉維酸高產(chǎn)菌株，并且后期克拉維酸的分離提取工藝相對(duì)落后［2］。

由于克拉維酸的生物合成受到某些基因的級(jí)聯(lián)調(diào)控，故某些調(diào)控基因的變化可能會(huì)使克拉維酸產(chǎn)量獲得顯著提高［3］，隨著對(duì)克拉維酸生物合成途徑研究的不斷深入，采用基因工程的方法構(gòu)建棒狀鏈霉菌的克拉維酸高產(chǎn)突變株越來(lái)越受到各國(guó)學(xué)者的廣泛關(guān)注。克拉維酸合成基因簇和頭霉素C合成基因簇相鄰，且受相同的調(diào)節(jié)蛋白CcaR的調(diào)控，研究表明，在發(fā)酵過(guò)程中降低或消除棒狀鏈霉菌中頭霉素C的合成能夠提高克拉維酸的產(chǎn)量［4］，并可以有效減少發(fā)酵液中的干擾物質(zhì)，簡(jiǎn)化提取工藝，對(duì)工業(yè)上克拉維酸的生產(chǎn)具有重要意義。

本課題組曾采用插入突變的方法成功構(gòu)建了棒狀鏈霉菌lat基因的突變菌株，結(jié)果突變株的克拉維酸產(chǎn)量較原始菌株提高了1.3倍［5］，本實(shí)驗(yàn)仍然從影響棒狀鏈霉菌克拉維酸代謝的頭霉素C的早期合成基因lat入手，采用PCR-Targeting體系對(duì)S.clavuligerus的lat基因進(jìn)行了突變。PCR-Targeting是2002年由Gust和Kieser等人［6］創(chuàng)建的，用于突變鏈霉菌中的野生型基因。該體系中的λRED(gam，bet，exo)功能啟動(dòng)子能夠極大地提高線性DNA的重組率，使得胞內(nèi)重組酶BCD、外切核酸酶分解線狀DNA，導(dǎo)致重組率低的問(wèn)題得以解決。采用該體系最終構(gòu)建得到了lat基因被敲除的無(wú)抗性標(biāo)記的突變菌株S.clavuligerus lat::scar，其克拉維酸產(chǎn)量最高達(dá)到了出發(fā)菌株的2.83倍。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

菌株:克拉維酸產(chǎn)生菌棒狀鏈霉菌Streptomyces clavuligerus NRRL3585，由沈陽(yáng)藥科大學(xué)何建勇教授惠贈(zèng);大腸桿菌 E.coli DH5α 和 E.coli ET12567，E.coli BW25113/pIJ790均為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

質(zhì)粒:pIJ773，提供阿泊拉抗性模板質(zhì)粒，在其抗性基因兩側(cè)包含轉(zhuǎn)移復(fù)制起始點(diǎn)oriT以及FLP重組酶的識(shí)別位點(diǎn) FRT序列，阿泊拉抗性(AprR);pGH112，大腸桿菌－鏈霉菌穿梭質(zhì)粒載體，帶有氨芐抗性(AmpR)和硫鏈絲菌肽抗性(tsrR);pELA，lat基因中插入阿泊拉抗性基因(lat::apr)的重組質(zhì)粒，帶有氨芐(AmpR)、硫鏈絲菌肽(tsrR)和阿泊拉抗性(AprR)。

1.2 培養(yǎng)基

E.coli ET12567/pUZ8002，E.coli BW25113 以及E.coliDH5α所用為L(zhǎng)B培養(yǎng)基［6］;棒狀鏈霉菌所用產(chǎn)孢培養(yǎng)基為YMGA培養(yǎng)基［7］，種子培養(yǎng)采用TSB培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)采用SS培養(yǎng)基［8］。大腸桿菌－鏈霉菌接合培養(yǎng)基采用AS-1培養(yǎng)基(g/L)［9］。

培養(yǎng)基中抗生素的使用濃度如下:氨芐青霉素終濃度為 100 μg/mL，阿泊拉霉素為 25 μg/mL，卡那霉素為 50 μg/mL，氯霉素為 25 μg/mL，萘啶酮酸為 25 μg/mL。

1.3 常規(guī)分子操作

棒狀鏈霉菌總DNA的提取、質(zhì)粒向鏈霉菌的接合轉(zhuǎn)移、鏈霉菌原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化均按Kieser等人［8］的方法進(jìn)行，大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取、限制性內(nèi)切酶消化、連接、PCR以及轉(zhuǎn)化等操作均按Sambrook 等人［10］的方法進(jìn)行。

1.4 引物設(shè)計(jì)及PCR

1.4.1 lat基因的 PCR 擴(kuò)增

參照棒狀鏈霉菌編碼賴氨酸ε－轉(zhuǎn)氨酶的lat基因相應(yīng)的核苷酸序列，設(shè)計(jì)合成如下引物:

引物 1:5’-GAATTC CCATAATTCAGCCTGATCCCCCAGGAGTTCTCA-3’

引物 2:5’-GGATCC AGCGCGTCCTTCACAGCGGTGTACTCCCGCCCGTCGACG-3’

其中引物1和引物2中劃線部分分別為EcoR I和BamH I酶切位點(diǎn)，以棒狀鏈霉菌的基因組DNA為模板，引物1和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，退火溫度n=61℃。

1.4.2 安普抗性框的PCR擴(kuò)增

根據(jù)棒狀鏈霉菌中l(wèi)at基因的序列及質(zhì)粒pIJ773中安普抗性基因的序列(該序列中還包含轉(zhuǎn)移復(fù)制起始點(diǎn)oriT以及FLP重組酶的識(shí)別位點(diǎn)FRT序列，oriT便于后面重組質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移)設(shè)計(jì)一對(duì)長(zhǎng)59nt及58nt的引物(引物3和引物4)，其中引物3包含20nt的安普抗性基因上游的FRT序列以及l(fā)at基因上游的一段39nt的互補(bǔ)序列，引物4包含19nt的安普抗性基因下游的FRT序列以及l(fā)at基因下游的一段39nt的互補(bǔ)序列(圖1.a)，兩引物序列如下:

引物 3:5’-CCATAATTCAGCCTGATCCCCCAGGAGTTCTCACCCATGATTCCGGGGATCCGTCGACC-

3’;引物 4:5’-TGTAGGCTGGAGCTGCTTCGACCGCTCGTCACAGTGCGGCCAGCGGCTCTCGCAGACT-3’。

按此引物PCR所得產(chǎn)物中應(yīng)包含一個(gè)安普抗性基因，并且在它的兩端含有各帶有39bp的lat基因上下游的同源序列，將此PCR產(chǎn)物稱為安普抗性框。

以含有安普抗性基因的質(zhì)粒pIJ773作為模板，引物3和引物4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，退火溫度n=50℃，進(jìn)行安普抗性框的擴(kuò)增。

1.5 PCR-targeting構(gòu)建重組質(zhì)粒

1.5.1 重組質(zhì)粒pGH112-lat的構(gòu)建

將PCR獲得的lat基因片段經(jīng)純化及EcoR I和BamH I雙酶切，與經(jīng)同樣雙酶切的大腸桿菌－鏈霉菌穿梭質(zhì)粒載體pGH112連接，所得的連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化 E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，得到重組質(zhì)粒pGH112-lat(圖1.b)。

1.5.2 重組質(zhì)粒pELA的構(gòu)建

將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒pGH112–lat電轉(zhuǎn)至Ecoli BW25113/pIJ790感受態(tài)中，獲得 E.coli BW25113/pIJ790/pGH112-lat轉(zhuǎn)化子，將其制作成感受態(tài)細(xì)胞，將1.4.2中得到的帶有l(wèi)at基因同源序列的PCR產(chǎn)物安普抗性框電轉(zhuǎn)化至E.coli BW25113/pIJ790/pGH112-lat感受態(tài)細(xì)胞中，將電轉(zhuǎn)后菌株的培養(yǎng)溫度由30℃提高到37℃，并在培養(yǎng)基中添加L-阿拉伯糖(終濃度為 10 mmol/L)。在 E.coli BW25113/pIJ790/pGH112-lat的培養(yǎng)基中添加L-阿拉伯糖可誘導(dǎo)pIJ790中λRED的表達(dá)，在λRED功能啟動(dòng)子的作用下，安普抗性框迅速地與重組質(zhì)粒pGH112-lat發(fā)生同源重組，即安普抗性框兩端的lat同源序列與pGH112-lat所攜帶的lat基因發(fā)生同源雙交換，從而使lat基因中插入了含有aac(3)iv基因的安普抗性框，得到了一個(gè)lat基因被插入突變的重組質(zhì)粒pELA(圖1.c)。由于pIJ790質(zhì)粒中含有一個(gè)溫敏型的復(fù)制起始子和氯霉素抗性基因，當(dāng)電轉(zhuǎn)后菌株的培養(yǎng)溫度由30℃提高到37℃并且不再向培養(yǎng)基中添加Cml抗生素后，pIJ790質(zhì)粒的復(fù)制子不再轉(zhuǎn)錄并且在沒(méi)有抗生素的選擇壓力下，它便逐漸喪失了自我復(fù)制的能力。所以重組子中僅含有一種帶有l(wèi)at突變基因的重組質(zhì)粒。

1.5.3 lat基因內(nèi)部被敲除的重組質(zhì)粒pSCAR的構(gòu)建

將含有安普抗性框的重組質(zhì)粒pELA(抗性框的兩端含有FRT序列，該序列為FLP重組酶的識(shí)別位點(diǎn))電轉(zhuǎn)至 E.coliDH5α/BT340中，BT340為溫敏型質(zhì)粒，因此E.coliDH5α/BT340的感受態(tài)細(xì)胞的制備及培養(yǎng)過(guò)程溫度均控制在較低的30℃。

在42℃高溫誘導(dǎo)下質(zhì)粒BT340可以表達(dá)FLP重組酶，F(xiàn)LP重組酶可以識(shí)別質(zhì)粒pELA中安普抗性框兩側(cè)的FRT序列，將FRT之間的抗性基因敲除，在此過(guò)程中質(zhì)粒BT340消失，之后原lat基因插入抗性基因的部分僅剩下81bp的scar序列(FRT序列經(jīng)FLP酶切除后剩余的部分序列)，所得為lat基因內(nèi)部被敲除的重組質(zhì)粒pSCAR(圖1.g)。

1.6 棒狀鏈霉菌lat基因的突變

重組質(zhì)粒pELA向棒狀鏈霉菌的轉(zhuǎn)移采用接合轉(zhuǎn)移的方法［8］，即以 E.coli ET12567/pUZ8002/pELA 為供體菌株，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至棒狀鏈霉菌中。篩選安普霉素抗性菌株，28℃培養(yǎng)3～5 d，直至孢子出現(xiàn)，收集孢子，將孢子在不含抗生素的YMGA培養(yǎng)基上進(jìn)行松弛培養(yǎng)，并在該培養(yǎng)基上傳代3次，仍具有抗性的菌株初步確定為發(fā)生了雙交換的菌株(圖1.d，e)。

重組質(zhì)粒pSCAR向棒狀鏈霉菌的轉(zhuǎn)移采用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法［8］，以25%的PEG1000介導(dǎo)，再生培養(yǎng)基采用R2YE培養(yǎng)基，由于重組質(zhì)粒pELA安普抗性框中的具有接合轉(zhuǎn)移功能的oriT基因也同時(shí)被敲除，所以得到的重組質(zhì)粒pSCAR為不具有接合轉(zhuǎn)移功能的質(zhì)粒(圖1.g)，須通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入棒狀鏈霉菌中。

轉(zhuǎn)化子于30℃培養(yǎng)36h長(zhǎng)出微小菌落后，用含8μg/mL硫鏈絲菌素(安普抗性框被敲除后采用重組質(zhì)粒pSCAR所攜帶的硫鏈絲菌素抗性基因tsr進(jìn)行篩選)的營(yíng)養(yǎng)瓊脂覆蓋各轉(zhuǎn)化平板，繼續(xù)于30℃培養(yǎng)3 d。用無(wú)菌牙簽挑取轉(zhuǎn)化子于不含抗生素的YMGA平板，30℃培養(yǎng)3～4 d后，將長(zhǎng)出的菌落分別于含有硫鏈絲菌素(Thio8)的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板及含有安普霉素(Apr25)的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上影印妥當(dāng)，對(duì)2種抗生素都敏感的菌落可初步斷定為lat基因中抗性基因被敲除的突變菌株(圖1.e～i)，PCR-Targeting構(gòu)建棒狀鏈霉菌突變株的流程見(jiàn)圖1。

圖1 PCR-Targeting突變lat基因的流程圖Fig.1 Strategy of PCR-Targeting for lat mutation

1.7 發(fā)酵液中克拉維酸的HPLC分析

發(fā)酵液于10 000 r/min離心10 min，所得上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，按1∶5的比例與咪唑溶液混勻，30℃反應(yīng)12 min后冷卻到20℃，生成的衍生物采用Shim-pack VP-ODS(150×4.6)C18色譜柱進(jìn)行HPLC 分析［11］。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將PCR獲得的lat基因片段用EcoR I和BamH I雙酶切，與經(jīng)同樣雙酶切的大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒載體 pGH112連接，轉(zhuǎn)化 E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，得到重組質(zhì)粒pGH112-lat。

將pGH112-lat及PCR獲得的安普抗性框電轉(zhuǎn)化至E.coli BW25113/pIJ790中，在 pIJ790中 λRED 的功能啟動(dòng)子的作用下，安普抗性框迅速地與重組質(zhì)粒pGH112-lat發(fā)生同源重組，從而使lat基因中插入了安普抗性框，得到了一個(gè)lat基因被插入突變的重組質(zhì)粒。以該重組質(zhì)粒為模板，以引物3、引物4進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 重組質(zhì)粒pELA的PCR驗(yàn)證Fig.2 PCR verification of recombinant plasmid pELA

由圖2可以看出，PCR產(chǎn)物大小在1.45kb處(圖中箭頭所指)，與安普抗性框大小相符。表明安普抗性框已成功整合到pGH112-lat的lat基因中，將該重組質(zhì)粒命名為pELA。

將pELA電轉(zhuǎn)至 E.coliDH5α/BT340中，BT340為溫敏型質(zhì)粒，在42℃高溫誘導(dǎo)下質(zhì)粒BT340可以表達(dá)FLP重組酶，F(xiàn)LP重組酶可以識(shí)別質(zhì)粒pELA中安普抗性框兩側(cè)的FRT序列(圖1.a)，將FRT之間的抗性基因敲除，原lat基因插入抗性基因的部分僅剩下81bp的scar序列(FRT序列經(jīng)FLP酶切除后剩余的部分序列)，所得為lat基因內(nèi)部被敲除的重組質(zhì)粒 pSCAR(圖 1.g)，其理論大小應(yīng)為 6.98kb。對(duì)所得轉(zhuǎn)化子進(jìn)行提質(zhì)粒及酶切驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖3，由圖可知電泳結(jié)果與其理論值大小相吻合，所得lat基因內(nèi)部被敲除的重組質(zhì)粒命名為pSCAR。

2.2 棒狀鏈霉菌基因突變株的驗(yàn)證

分別以棒狀鏈霉菌出發(fā)菌株、lat基因中插入安普抗性框的突變株及抗性標(biāo)記被敲除的突變株的基因組DNA作為模板，以lat基因上下游引物(引物1，引物2)進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知以抗性標(biāo)記被敲除的突變株基因組為模板的PCR產(chǎn)物大小在400bp－500bp之間，與理論值481bp相一致(安普抗性框兩側(cè)的39bp距l(xiāng)at基因的上下游分別為230bp和170bp，以及81bp的scar序列)，而對(duì)照菌株基因組的PCR產(chǎn)物為1.8kb，以lat基因雙交換突變株的基因組DNA作為模板的PCR產(chǎn)物為1.85kb(lat基因中的191～1 600bp被1.45kb的安普抗性基因所取代，因此PCR產(chǎn)物理論大小應(yīng)為1.85kb)，證明lat基因中的抗性基因已經(jīng)被敲除，所得的抗性標(biāo)記被敲除的lat基因突變菌株，命名為S.clavuligerus lat::scar。

圖3 重組質(zhì)粒pSCAR的酶切驗(yàn)證Fig.3 Verification of recombinant plasmid pSCAR

圖4 突變株的PCR驗(yàn)證Fig.4 PCR verification of the mutants

2.3 突變菌株克拉維酸產(chǎn)量的測(cè)定

對(duì)突變菌株lat::scar及出發(fā)菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，采用HPLC法對(duì)發(fā)酵120 h的發(fā)酵液進(jìn)行克拉維酸含量的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，對(duì)同樣的發(fā)酵液測(cè)定其克拉維酸的產(chǎn)量，結(jié)果突變菌株的克拉維酸產(chǎn)量最高可達(dá)166 mg/L，是出發(fā)菌株的2.83倍，表明采用PCR-Targeting的方法對(duì)lat基因進(jìn)行敲除有效提高了棒狀鏈霉菌的克拉維酸產(chǎn)量。

表1 突變菌株及原始菌株發(fā)酵液中克拉維酸產(chǎn)量的HPLC測(cè)定結(jié)果Table 1 HPLC analysis of clavulanic acid production of lat mutants and the original strain

3 結(jié)果討論

本實(shí)驗(yàn)從影響棒狀鏈霉菌克拉維酸代謝的頭霉素C的早期合成基因lat入手，采用PCR-Targeting構(gòu)建了棒狀鏈霉菌的lat基因被敲除的無(wú)抗性標(biāo)記的突變菌株 S.clavuligerus lat::scar。

采PCR-Targeting構(gòu)建的重組質(zhì)粒由于具有接合轉(zhuǎn)移功能，易于轉(zhuǎn)入棒狀鏈霉菌中，并且由于插入到突變的目標(biāo)基因中的選擇標(biāo)記抗性框兩端帶有FRT序列，可通過(guò)FLP重組酶的識(shí)別作用方便的將最終所得的棒狀鏈霉菌工程菌株中的抗性基因敲除，得到無(wú)抗性的lat基因敲除的突變菌株，所得的不同突變株的克拉維酸產(chǎn)量是原始出發(fā)菌株的1.82～2.83倍。由于最終所得突變株無(wú)抗性標(biāo)記，因此可以重復(fù)的將該方法應(yīng)用于突變棒狀鏈霉菌的其他基因，實(shí)現(xiàn)用一種抗性標(biāo)記突變同一菌株不同基因的目的，從而使突變同一菌株的多條基因時(shí)需要多種選擇性標(biāo)記的問(wèn)題得以解決，為鏈霉菌的基因工程方法改造提供了又一種可行的方法。

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