徐頂巧，周建軍

(陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中，723000)

烏骨雞(Gallus gellus demesticus Brissen)又名烏雞，屬于鳥(niǎo)綱、雞形目、雉科、雞屬。烏骨雞的藥用價(jià)值和食用價(jià)值存在于體內(nèi)黑色素物質(zhì)，其具有抗誘變、提高機(jī)體免疫力、延緩衰老、抑制病毒、消除自由基、抗氧化等功能［1－5］，烏骨雞黑色素已被證實(shí)是真黑色素［6］。

黑色素是一種不溶于水和幾乎所有溶劑的生物多聚體［7］，黑色素的提取方法有蛋白酶解法、鹽酸水解法等。蛋白酶解法提取時(shí)對(duì)黑色素在形態(tài)學(xué)和化學(xué)結(jié)構(gòu)上損傷的程度小于鹽酸法，且清除自由基的效果略?xún)?yōu)于鹽酸法，但其成本較高且在光穩(wěn)定性方面要低;鹽酸水解法對(duì)黑色素的形態(tài)和化學(xué)結(jié)構(gòu)有一定損傷，但其光穩(wěn)定性較好，操作簡(jiǎn)單易行［8］。

以烏骨雞肉、內(nèi)臟作為原材料提取黑色素的方法已有文獻(xiàn)報(bào)道，但其原材料成本較高，難以應(yīng)用，僅停留在實(shí)驗(yàn)室階段。本實(shí)驗(yàn)以廢棄的黑羽烏骨雞毛為原料，利用鹽酸水解法從烏骨雞毛中提取黑色素，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上通過(guò)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析法對(duì)烏骨雞毛中黑色素提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料、儀器與試劑

Waters e2695－2489高效液相色譜儀，配有2489紫外檢測(cè)器和Empower色譜工作站，自動(dòng)進(jìn)樣，美國(guó)Waters公司;AB204－S電子天平，瑞士Mettler Toledo公司;KQ5200DE型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;D-37520 Osterde離心機(jī)，德國(guó) Kendro制造;MH-1000電熱套，北京科偉永興儀器有限公司;302型電熱鼓風(fēng)干燥箱，山東濰坊醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司醫(yī)療器械廠(chǎng);SHB-III循環(huán)式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

濃HCl，北京化工廠(chǎng)，分析純;NaOH，西隴化工股份有限公司，分析純;石油醚，天津市富宇精細(xì)化工有限公司，分析純;甲酸、30%H2O2、K2CO3、Na2SO3，天津市天力化學(xué)試劑有限公司，分析純;甲醇 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，色譜純;5-羥基吲哚-2-羧酸，Sigma公司。

黑羽烏骨雞雞毛，取自漢中市黑鳳園烏雞養(yǎng)殖基地，平均日齡150 d。烏骨雞毛經(jīng)洗滌晾曬，于65℃烘干備用。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 烏骨雞毛黑色素的檢測(cè)方法

2.1.1 色譜條件

參考Ito的方法［9］，并經(jīng)試驗(yàn)色譜條件確定為:色譜柱 ODS-3 C18柱 (150 mm ×4.6 mm，4 μm)，檢測(cè)波長(zhǎng):270 nm，流速1.0 ml/min，柱溫25℃，進(jìn)樣量10 μL，流動(dòng)相 V(1% 甲酸)∶V(甲醇)=60∶40，保留時(shí)間:30 min。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備

2，3，5-三羧基吡咯(PTCA)的制備參考 Ito的方法［9］:精密稱(chēng)取 5-羥基吲哚-2-羧酸 50 mg，溶于 50 mL 1.0 mol/L K2CO3溶液中，加入體積分?jǐn)?shù)30%H2O22 mL，置100℃加熱20 min。流水冷卻，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%Na2SO33.0 mL終止反應(yīng)，用6.0 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至1左右，冷卻，用50 mL乙醚萃取5次，合并乙醚萃取液，萃取液濃縮到一定體積，揮干乙醚真空干燥。精密稱(chēng)取10 mg沉淀，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%甲酸定容至25 mL，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液(PTCA 濃度為400 μg/mL)。

精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分別置于5個(gè)10 mL的容量瓶中，用0.1%甲酸溶液定容，混勻，即配成濃度為20、40、60、80、100 μg/mL的5個(gè)不同濃度的對(duì)照品溶液。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

將5個(gè)不同濃度的PTCA對(duì)照品溶液依次分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，以濃度(X)為橫坐標(biāo)，用直線(xiàn)回歸方程的方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，PTCA的直線(xiàn)方程為:Y=9.96×103X－4.99×104(r=0.999 203)，其濃度在20.00 ～100.00 μg/mL內(nèi)，線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.1.4 供試品的氧化處理及測(cè)定

分別精密稱(chēng)取(單因素實(shí)驗(yàn))提取時(shí)間3、6 h所得黑色素粗品和響應(yīng)面模型驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)所得黑色素粗品各10 mg，加入1.0 mol/L K2CO38.6 mL和體積分?jǐn)?shù)3%H2O20.8 mL，置100℃水浴20 min，流水冷卻后，加入10%Na2SO30.4 mL終止反應(yīng)，用6.0 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至1左右，過(guò)濾后取上清液，用50 mL乙醚萃取5次，合并乙醚萃取液，萃取液濃縮到一定體積，揮干乙醚抽真空干燥后，用流動(dòng)相復(fù)溶，定容至25 mL，用0.45 μm有機(jī)膜過(guò)濾，與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相同的色譜條件下進(jìn)樣，重復(fù)進(jìn)樣3次，取平均值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出PTCA的含量，通過(guò)黑色素對(duì)照樣品與PTCA含量間的換算系數(shù)，得出供試品中黑色素的含量。

2.1.5 烏骨雞毛中黑色素含量與PTCA含量換算系數(shù)的確定

稱(chēng)取鹽酸水解黑色素300 mg置于水解裝置中，加入10 mol/L HCl 120 mL，密封置于120℃烘箱內(nèi)完全水解12 h。揮干鹽酸后，蒸餾水洗凈，沉淀黑色素低溫干燥，作為烏骨雞毛黑色素樣品。分別精密稱(chēng)取烏骨雞毛黑色素對(duì)照樣品10 mg，參考2.1.2對(duì)照品溶液的制備方法進(jìn)行氧化處理，得到對(duì)照樣品溶液，按3.1.1同樣色譜條件進(jìn)樣，測(cè)得對(duì)照樣品PTCA含量，建立樣品黑色素與PTCA含量間的換算關(guān)系。烏骨雞毛黑色素樣品的對(duì)照品氧化后PTCA含量見(jiàn)表1。烏骨雞毛黑色素氧化后PTCA平均得率為16.18%，RSD為0.344% 。因此烏骨雞毛黑色素與PTCA間的關(guān)系即:黑色素=6.21×PTCA(mg)。

表1 黑色素對(duì)照品氧化后PTCA含量Table 1 PTCA yield of the oxygenated standard substance of melanin

2.2 烏骨雞毛黑色素的提取

采用HCl水解法提取，選擇HCl濃度、料液比和提取時(shí)間進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，并以黑色素得率(黑色素得率/%=黑色素質(zhì)量/原材料質(zhì)量×100)為指標(biāo)，確定最佳的提取條件，并對(duì)最佳提取條件進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)。

2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1.1 鹽酸濃度對(duì)黑色素得率的影響

稱(chēng)取30 g烏骨雞毛，置1 000 mL圓底燒瓶，分別加入10%、15%、20%、25%、30%HCl溶液 150 mL，用帶有吸收氯化氫的熱回流裝置，在110～112℃條件下，熱回流提取5 h，冷卻至室溫后通過(guò)滌綸紗布粗濾。將濾液在3 800 r/min條件下離心10 min，棄上清液。沉淀經(jīng)過(guò)多次水洗直到pH為中性，在65℃條件下烘干，即得黑色素粗品。將粗品以1∶10(g∶mL)加入石油醚，超聲2次，每次0.5 h，抽濾，真空干燥得到黑色素樣品，稱(chēng)重以考察鹽酸濃度對(duì)黑色素得率的影響。

2.2.1.2 料液比對(duì)黑色素得率的影響

稱(chēng)取30 g烏骨雞毛，置1 000 mL圓底燒瓶，分別按 1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5 加入 25%HCl提取，其他條件固定不變，以考察料液比對(duì)黑色素得率的影響。

2.2.1.3 提取時(shí)間對(duì)黑色素得率的影響

稱(chēng)取30 g烏骨雞毛，置1 000 mL圓底燒瓶，其它條件固定不變，分別提取2、3、4、5、6 h，以考察提取時(shí)間對(duì)黑色素得率的影響。

2.2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，選取料液比 X1(1∶1～1∶3)、HCl濃度 X2(20% ～30%)、提取時(shí)間X3(5～7 h)3個(gè)對(duì)烏骨雞毛黑色素得率影響顯著的因素，以黑色素得率為響應(yīng)值，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析法，設(shè)計(jì)方案見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面分析因素與水平Table 2 Variables and levels in response surface design

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1.1 鹽酸濃度對(duì)黑色素得率的影響

HCl濃度對(duì)黑色素得率的影響結(jié)果見(jiàn)圖1所示。

圖1 HCl濃度對(duì)黑色素得率的影響Fig.1 Effect of the concentration of hydrochloric acid on melanin yield

由圖1可知，隨著HCl濃度的升高，黑色素得率呈明顯遞增趨勢(shì)，當(dāng)HCl濃度達(dá)到30%后，黑色素得率最高，在反應(yīng)過(guò)程中，由于HCl在沸騰狀態(tài)極強(qiáng)的揮發(fā)性，再提高HCl濃度黑色素得率也不明顯遞增，故HCl濃度以25%為宜。

3.1.2 提取時(shí)間對(duì)黑色素得率的影響

提取時(shí)間對(duì)黑色素得率的影響結(jié)果見(jiàn)圖2所示。

圖2 提取時(shí)間對(duì)黑色素得率的影響Fig.2 Effect of the extraction time on melanin yield

由圖2可知，3 h內(nèi)隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，黑色素的得率呈明顯遞增趨勢(shì)，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到3 h后，黑色素得率隨提取時(shí)間延長(zhǎng)而降低，到5 h后，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)黑色素得率稍有回升，6 h后隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)黑色素得率趨于穩(wěn)定。上述曲線(xiàn)表明，3 h之前可能是水解過(guò)程中未完全除去與黑色素結(jié)合的蛋白質(zhì)及脂類(lèi)物質(zhì)，因此黑色素得率增高;3 h后，隨著與黑色素結(jié)合的蛋白質(zhì)水解，黑色素得率逐步降低，6～7 h黑色素得率逐步穩(wěn)定。為了證實(shí)上述推測(cè)對(duì)3、6 h提取的黑色素進(jìn)行了含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 水解3 h及6 h樣品中PTCA得率及黑色素含量Table 3 The yield of PTCA and the content of melanin in the sample of hydrolysis in 3 h and 6h

由表3可知，水解3h黑色素樣品PTCA得率為4.31%，黑色素含量?jī)H為26.77%;而水解6h黑色素樣品PTCA得率為12.18%，黑色素含量為75.63%，無(wú)論是PTCA得率，還是黑色素的含量都明顯高于水解3h的含量，因此水解時(shí)間選為6 h。

3.1.3 料液比對(duì)黑色素得率的影響

料液比對(duì)黑色素得率的影響結(jié)果見(jiàn)圖3所示。

圖3 料液比對(duì)黑色素得率的影響Fig.3 Effect of the material liquid ratio on melanin yield

由圖3可知，隨著料液比的增大，黑色素得率呈明顯遞增趨勢(shì)，當(dāng)料液比達(dá)到1∶2后，黑色素得率趨于平緩，故料液比以1∶2為宜。

3.2 響應(yīng)面結(jié)果及分析

響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。表4中1～12是析因試驗(yàn)，13～17是中心試驗(yàn)。17個(gè)試驗(yàn)為析因點(diǎn)和零點(diǎn)，其中分析因點(diǎn)為自變量取值在X1、X2、X3所構(gòu)成的三維頂點(diǎn);零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，用以估計(jì)誤差。

表4 響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Arrangement and experimental results of response surface central composite design

由表5中回歸模型的方差分析可知，上述回歸方程中因變量與各自變量之間線(xiàn)性關(guān)系顯著(r=模型平方和/總離差平方和=0.995 2)，該模型高度顯著(P＜0.000 1)，說(shuō)明此實(shí)驗(yàn)方法可靠。同時(shí)由于回歸方程的失擬誤差不顯著(P=0.642 1)，因此該回歸方程可用于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析和預(yù)測(cè)。各因素的方差分析表明，X1、X2、X3、X1X2、X2X3、對(duì)黑色素得率的影響顯著，由此可知各因素對(duì)黑色素得率的影響不是線(xiàn)性關(guān)系。由分析結(jié)果可知，HCl濃度、提取時(shí)間和料液比對(duì)黑色素得率的影響都達(dá)到了高度顯著的水平，其中料液比對(duì)黑色素得率的影響最顯著。

RSM圖形是響應(yīng)值Y對(duì)應(yīng)各因素X1、X2、X3構(gòu)成的三維空間圖及三維空間圖在二維平面上的等高線(xiàn)圖，本實(shí)驗(yàn)的RSM圖見(jiàn)4～圖6。各個(gè)因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響可以直觀(guān)的反映出來(lái)，其中等高線(xiàn)的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，圓形則與之相反。

表5 回歸模型方差分析Table 5 ANONA(analysis of variance)of terms of regression equation

圖4 料液比和HCl濃度對(duì)黑色素得率的影響Fig.4 response surface plot showing the effects of water/material ratio and the concentration of hydrochloric acid on extraction yield of melanin

通過(guò)對(duì)RSM圖進(jìn)行比較可知，3個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性表現(xiàn)為曲線(xiàn)的陡度排列為X1(料液比)﹥X2(鹽酸濃度)﹥X3(提取時(shí)間)，即3個(gè)因素對(duì)黑色素得率影響顯著性大小為料液比﹥HCl濃度﹥提取時(shí)間，該結(jié)論與回歸方程方差分析的分析結(jié)果相吻合。

回歸模型預(yù)測(cè)的烏骨雞毛黑色素提取的最佳工藝為:料液比1∶2.21，鹽酸濃度27.37%，提取時(shí)間6.11 h，在此條件下黑色素得率為4.75%。

圖5 料液比和提取時(shí)間對(duì)黑色素得率的影響Fig.5 Response surface plot showing the effects of water/material ratio and extraction time on extraction yield of melanin

圖6 鹽酸濃度和提取時(shí)間對(duì)黑色素得率的影響Fig.6 Response surface plot showing the effects of the concentration of hydrochloric acid and extraction time on extraction yield of melanin

3.3 模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

稱(chēng)取烏骨雞毛約100 g，結(jié)合實(shí)際操作情況，將最佳工藝條件修正為:料液比1∶2，鹽酸濃度27%，回流提取6 h，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)取均值對(duì)回歸模型進(jìn)行驗(yàn)證，模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 模型驗(yàn)證結(jié)果Table 6 The results of confirmatory test

由表6可知，實(shí)測(cè)黑色素平均得率為4.72%，該結(jié)果與模型預(yù)測(cè)值基本相符。

3.4 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)所得黑色素粗品中黑色素含量的測(cè)定

驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)所得黑色素粗品中黑色素含量的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 樣品中PTCA得率及黑色素含量Table 7 The yield of PTCA and the content of melanin in the sample

4 討論

本實(shí)驗(yàn)以黑羽烏骨雞毛為試材，利用鹽酸水解法提取黑色素，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析方法得到了與烏骨雞毛中黑色素提取工藝實(shí)際擬合程度較高的模型以及優(yōu)化的烏骨雞毛中黑色素的提取工藝條件:料液比1∶2(g∶mL)，酸濃度27%，提取時(shí)間6h，在此條件下烏骨雞毛中黑色素得率為4.72%。提取的黑色素樣品經(jīng)氧化處理，HPLC檢測(cè)，樣品中 PTCA得率為 12.27%，黑色素含量為76.20%。

朱方［10］以烏骨雞肌肉為材料，用鹽酸回流法提取黑色素，工藝條件為提取溫度95℃，料液比1∶4(g∶mL)，時(shí)間2h，其烏骨雞黑色素得率為0.458%，與之方法相比，本實(shí)驗(yàn)提高了熱回流的溫度、HCl的濃度及提取時(shí)間，所得樣品中黑色素平均得率提高了約10倍;林霖［11］同樣以烏骨雞肌肉為材料，用酶法提取黑色素，其樣品中黑色素含量為63.19%，與其結(jié)果相比，本實(shí)驗(yàn)所得樣品中黑色素平均含量提高了13%。因此從廢棄的烏骨雞毛中提取黑色素，不僅降低了黑色素的生產(chǎn)成本，而且能變廢為寶，為黑色素的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供了參考依據(jù)。

［1］ 胡國(guó)斌，鄭從義.色素抑制流感病毒誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡［J］.中國(guó)病毒學(xué)，1999，14(2):140－146.

［2］ 王哲鵬，鄧學(xué)梅.烏雞黑色素對(duì)果蠅的紫外輻射保護(hù)作用［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，12(1):17－21.

［3］ 李華，邱祥聘，龍繼蓉.烏骨雞黑色素的研究進(jìn)展［J］.畜牧與獸醫(yī)，2002，34(8):33 －35.

［4］ 胡泗才，李明慧，郭琴.泰和烏骨雞及其黑素對(duì)小鼠紅細(xì)胞過(guò)氧化氫酶及血漿過(guò)氧化脂質(zhì)的影響［J］.南昌大學(xué)學(xué)報(bào):理科版，1999，23(4):105－107.

［5］ 蔡華珍，陳守江，張麗，等.烏骨雞黑色素的酶法提取及其抗氧化作用的初步研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32(1):99－102.

［6］ 周偉偉，陳中，芮漢明.烏雞黑色素的研究進(jìn)展［J］.食品與機(jī)械，2006，22(4):134 －137.

［7］ Cesadni J P.Melanins and their possible roles through Biological evolution［J］.Advances in Space Research，1996，18(12):35－40.

［8］ 劉子暄，王小鶯，嚴(yán)明.泰和烏骨雞黑色素提取方法的研究進(jìn)展［J］.中獸醫(yī)學(xué)雜志，2009年增刊，552－555.

［9］ Ito S，F(xiàn)ujita K.Microanalysis of eumelanin and pheomelanin in hair and melanoma by chemical degradation and liquid chromatography［J］.Anal Biochemistry，1985，144:527－536.

［10］ 朱方，倪志明，張英，等.泰和烏雞黑色素提取工藝的研究［J］.食品與機(jī)械，2012，28，(3):144 －147.

［11］ 林霖.烏骨雞多肽產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)及其黑色素提取和含量測(cè)定研究［D］.南昌:南昌大學(xué)，2007.