郭凱敏，崔小穎，張達(dá)，鄭輝杰，吳兆亮

(河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院生物工程系，天津，300130)

乳鏈菌肽(nisin)亦稱乳酸鏈球菌素，是由乳酸乳球菌發(fā)酵生產(chǎn)的一種肽類細(xì)菌素，由34個(gè)氨基酸組成［1-2］，分子質(zhì)量為3 500 Da。它對(duì)許多 G+菌有很強(qiáng)的抑制作用［3-4］，且安全、無毒，廣泛應(yīng)用于肉制品、乳制品、發(fā)酵食品等的防腐，是國際上公認(rèn)的天然食品防腐劑［5-6］。

微生物發(fā)酵生產(chǎn)nisin過程中，nisin對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)特別是自身的合成具有顯著的抑制作用，從而限制了nisin產(chǎn)量的提高，因此解除產(chǎn)物的抑制作用將會(huì)大幅度提高產(chǎn)量［7-9］。在以往報(bào)道的發(fā)酵分離耦合過程中，其分離方法如吸附法［10］、膜分離［8］等方法往往因存在成本高、操作困難等問題，使發(fā)酵分離耦合過程難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。因此，尋找一種合適的分離方法來實(shí)現(xiàn)發(fā)酵分離耦合顯得尤為重要。泡沫分離又稱泡沫吸附分離［11］，是一種簡(jiǎn)單、高效的分離方法，其根據(jù)表面吸附原理，向含有表面活性物質(zhì)的液體中鼓泡，使液體內(nèi)的表面活性物質(zhì)聚集在氣液界面，在液相主體上方形成泡沫層，將泡沫層和液相主體分開，就可以得到濃縮表面活性物質(zhì)的目的。它因具有成本低，效率高，操作簡(jiǎn)單，容易實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成功應(yīng)用于多種表面活性劑的分離［12-15］。對(duì)于 nisin，其分子結(jié)構(gòu)既有親水基團(tuán)，又有疏水基團(tuán)，具有一定的表面活性，可以將泡沫分離技術(shù)和發(fā)酵進(jìn)行耦合來進(jìn)行生產(chǎn)。

本文首先確定了發(fā)酵泡沫分離耦合的最佳操作條件，并在此條件下，進(jìn)行了發(fā)酵分離耦合實(shí)驗(yàn)。在此基礎(chǔ)上，研究了補(bǔ)料結(jié)合的發(fā)酵分離耦合，并對(duì)不同的發(fā)酵工藝進(jìn)行了對(duì)比。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

生產(chǎn)菌株:乳酸乳球菌菌株，由天津康益生物工程有限公司提供。

效價(jià)檢測(cè)菌株:藤黃八疊球菌，購于中國科學(xué)院微生物所菌種保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨 3.8，酵母膏 1.9，蔗糖40，KH2PO415，NaCl 2，MgSO40.2，玉米漿 25;pH 7.6，121 ℃滅菌20 min。

檢測(cè)培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨8，酵母浸粉5，NaCl 5，葡萄糖 5，Na2HPO42，瓊脂 7.5，吐溫 20 5 mL/L;pH 7.2，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 發(fā)酵泡沫分離耦合操作裝置圖

圖1 發(fā)酵泡沫分離耦合裝置圖Fig.1 The diagram of fermentation coupled with foam separation

發(fā)酵泡沫分離耦合操作裝置如圖1所示(恒溫磁力攪拌器在圖中未顯示)，在進(jìn)行耦合操作時(shí)，通過空氣分布器向發(fā)酵罐中通入無菌空氣產(chǎn)生氣泡，根據(jù)表面吸附原理，發(fā)酵液中具有表面活性的物質(zhì)吸附在氣泡的氣液相界面上，隨著氣泡的上升，在發(fā)酵液上方形成泡沫層。這時(shí)，泡沫層中的持液量很高，由于泡沫排液，上升的泡沫層持液量逐漸減少達(dá)到穩(wěn)定值，最后收集該泡沫，得到濃縮的產(chǎn)物，從而緩和或解除了發(fā)酵液中產(chǎn)物的抑制作用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 檢測(cè)方法

根據(jù)文獻(xiàn)［16］采用瓊脂擴(kuò)散法(ADT)定量分析nisin效價(jià)，根據(jù)文獻(xiàn)［17］采用比濁法測(cè)定菌體生長(zhǎng)曲線。

1.2.2 發(fā)酵泡沫分離耦合操作條件的優(yōu)化

在發(fā)酵的第8 h開始進(jìn)行泡沫分離耦合操作，這是因?yàn)?一方面，nisin發(fā)酵在第8 h開始進(jìn)入穩(wěn)定期，這時(shí)進(jìn)行耦合操作對(duì)生產(chǎn)菌的生長(zhǎng)影響較小;另外，此時(shí)發(fā)酵液中已積累一定量的nisin，需要及時(shí)移除以便緩解產(chǎn)物的抑制作用。

在進(jìn)行泡沫分離耦合時(shí)，由于進(jìn)行通氣操作不可避免地會(huì)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生影響，這可能是由于通入的氣體對(duì)生產(chǎn)菌及nisin的活性有影響［18］，也可能是由于通氣時(shí)形成的剪切力造成的nisin失活。因此，必須要對(duì)耦合操作條件進(jìn)行優(yōu)化，使產(chǎn)物nisin的損失降到最低。在之前本課題組的研究中［18］，確定了nisin發(fā)酵的最適pH梯度(5.75～6.25)、理想的通氣速率(30～50 mL/min)和通氣持續(xù)時(shí)間(60～120 min)。在此基礎(chǔ)上，本文通過正交試驗(yàn)對(duì)通氣速率、發(fā)酵的pH值和通氣持續(xù)時(shí)間這3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，確定最適的耦合操作條件，使nisin的損失最小。下面為正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表(表1)。

表1 正交試驗(yàn)因素及水平表Table 1 Experimental factors and levels for orthogonal-designing experiments

1.2.3 底物起泡性能和補(bǔ)料組分的確定

發(fā)酵泡沫分離耦合過程中生成的產(chǎn)物nisin和營養(yǎng)組分不可避免地會(huì)隨著形成的泡沫帶出反應(yīng)體系，因此補(bǔ)料對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)和nisin生產(chǎn)都具有重要的影響。補(bǔ)料組分的確定應(yīng)遵循以下原則，即某種營養(yǎng)物質(zhì)的起泡性能越好也就越容易被帶出反應(yīng)體系，也就越需要向反應(yīng)體系中補(bǔ)充其含量。底物的起泡性能通過羅氏泡沫儀在30℃下進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 補(bǔ)料時(shí)間的確定

在分批發(fā)酵中，自發(fā)酵開始后每1 h取1次樣，測(cè)定菌體生長(zhǎng)曲線、蔗糖消耗曲線和nisin合成曲線以確定合適的補(bǔ)料時(shí)間。

1.2.5 補(bǔ)料體積的確定

分別將 0、50、100、150、200 和 250 mL 的補(bǔ)料溶液在發(fā)酵的第12 h加入到發(fā)酵體系中，測(cè)定各組的nisin效價(jià)，確定合適的補(bǔ)料體積。

1.2.6 不同生產(chǎn)工藝對(duì)nisin發(fā)酵的影響

按4種方式分別進(jìn)行發(fā)酵:(1)進(jìn)行非補(bǔ)料非耦合的發(fā)酵(對(duì)照組);(2)進(jìn)行耦合的發(fā)酵(耦合組);(3)進(jìn)行只有補(bǔ)料的發(fā)酵(補(bǔ)料組);(4)進(jìn)行既補(bǔ)料又耦合的發(fā)酵(補(bǔ)料耦合組)。測(cè)定每種發(fā)酵方式的單位nisin效價(jià)以及總產(chǎn)量，進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵泡沫分離耦合操作條件的確定

在nisin發(fā)酵泡沫分離耦合過程中，由于通氣速率、pH值和通氣持續(xù)時(shí)間對(duì)發(fā)酵的影響比較大，因此本部分以產(chǎn)物nisin的失活率(I)為指標(biāo)通過正交試驗(yàn)來考察這3個(gè)因素對(duì)nisin生產(chǎn)的不利影響。正交試驗(yàn)的分析結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析Table 2 Analysis of orthogonal-designing experiments

nisin的失活率(I)在進(jìn)行耦合操作結(jié)束時(shí)進(jìn)行計(jì)算，以沒有進(jìn)行耦合操作的發(fā)酵作為對(duì)照組。計(jì)算方式如下:

其中，實(shí)驗(yàn)組中的nisin效價(jià)包括發(fā)酵液和泡沫液中的nisin效價(jià)。

在表2中，Tij(i=1，2，3)分別為不同因素不同水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果的總和;Mij(i=1，2，3;j=1，2，3)分別為不同因素不同水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值;Rj分別為各因素列的極差。

對(duì)極差進(jìn)行分析，由于RB＞RC＞RA，即影響nisin失活率的3個(gè)實(shí)驗(yàn)因素的主次關(guān)系為B(pH)＞C(通氣持續(xù)時(shí)間)＞A(氣速)，可得到較好的試驗(yàn)條件為 A2B1C2，即氣速為 40 mL/min，pH 為 5.75，通氣持續(xù)時(shí)間為90 min的耦合操作可以得到最小的nisin失活率6.1%。

在上述優(yōu)化條件下進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，并與對(duì)照組進(jìn)行比較，結(jié)果如圖2所示。

圖2 發(fā)酵泡沫分離耦合對(duì)nisin效價(jià)的影響Fig.2 Effects of fermentation coupled with foam separation on nisin activity

由圖2可知，與對(duì)照組相比，在進(jìn)行耦合操作之后，得到nisin的失活率為5.75%。但是，在之后的發(fā)酵過程中，nisin效價(jià)持續(xù)上升并在發(fā)酵的第12 h達(dá)到最大4 422 IU/mL。這表明，進(jìn)行泡沫分離耦合操作有利于nisin的發(fā)酵生產(chǎn)，這主要?dú)w因于nisin產(chǎn)物抑制作用的解除或緩和，這與很多的報(bào)道相一致［8-10］。但是與對(duì)照組的最大nisin效價(jià)4 173 IU/mL相比較，并沒有太大的提高，而且達(dá)到最大值后nisin效價(jià)下降也較快，這可能是因?yàn)樵诎l(fā)酵過程中，由于菌體對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消耗以及耦合操作過程中營養(yǎng)物質(zhì)隨上升的泡沫被帶出從而導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)不足造成的。因此，有必要在發(fā)酵的第12 h進(jìn)行補(bǔ)料來驗(yàn)證耦合操作實(shí)驗(yàn)。

2.2 底物起泡性能和補(bǔ)料組分的確定

在進(jìn)行補(bǔ)料之前，首先對(duì)發(fā)酵液中各營養(yǎng)組分的起泡性能進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果如表3所示。

表3 發(fā)酵液中各組分的起泡性能Table 3 Foaming properties of components in the fermentation media

由表3可知，反應(yīng)體系中玉米漿的起泡性能最好，酵母膏和蛋白胨次之，而碳源(蔗糖)的起泡性能較差。這表明反應(yīng)體系中氮源(玉米漿，酵母膏和蛋白胨)會(huì)被大量帶出來，需要補(bǔ)充其含量。蔗糖雖然不易被帶出反應(yīng)體系，但由于耦合過程中解除了nisin對(duì)菌體生長(zhǎng)的抑制，菌體需要更多的碳源來滿足其快速生長(zhǎng)的能量需求，因此蔗糖液需要進(jìn)行補(bǔ)加，這些補(bǔ)加組分濃度與初始發(fā)酵液濃度相一致。

2.3 補(bǔ)料時(shí)間的確定

nisin的分批發(fā)酵如圖3所示，在發(fā)酵的0～3 h為菌體生長(zhǎng)的延滯期，此時(shí)蔗糖的消耗量以及nisin的生成量都很少。之后菌體進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，到第14 h時(shí)菌體迅速增加至最大值，此時(shí)細(xì)胞干重為4.10 g/L。同時(shí)隨著菌體在指數(shù)期的迅速增大，nisin也隨著迅速生成，在發(fā)酵的第13 h nisin的效價(jià)達(dá)到最大值4 173 IU/mL，此時(shí)蔗糖消耗殆盡。從圖3中可以看到在發(fā)酵的第12 h，蔗糖濃度已下降至10 g/L，而且在耦合操作過程中，會(huì)有一部分營養(yǎng)組分隨形成的泡沫液帶出，因此應(yīng)在此時(shí)進(jìn)行補(bǔ)料，防止蔗糖濃度過低影響最終nisin的產(chǎn)量。

圖3 乳鏈菌肽分批發(fā)酵曲線圖Fig.3 The curve of nisin production in batch fermentation

2.4 補(bǔ)料體積的確定

在耦合發(fā)酵的第12 h，向發(fā)酵反應(yīng)體系中分別補(bǔ)加0、50、100、150、200 和250 mL 的料液(2.2 確定的營養(yǎng)物)，其結(jié)果如圖4所示，在補(bǔ)加不同體積的料液后，發(fā)酵液中的nisin效價(jià)都有明顯的下降，并且隨著補(bǔ)加料液體積的增加，nisin效價(jià)下降的幅度增加，這主要是由于補(bǔ)料對(duì)發(fā)酵液稀釋的作用導(dǎo)致的?？梢钥吹?，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，發(fā)酵液中的nisin效價(jià)顯著上升，并且補(bǔ)料體積為100 mL時(shí)，取得最高的nisin效價(jià)4 813 IU/mL，這表明在發(fā)酵后期的補(bǔ)料促進(jìn)了nisin的合成。較大的補(bǔ)料體積不僅會(huì)造成底物的抑制，而且會(huì)增加生產(chǎn)成本，而低的補(bǔ)料體積不足以彌補(bǔ)耦合過程中帶出的營養(yǎng)成分，綜合考慮，選取100 mL為補(bǔ)料體積。

圖4 不同補(bǔ)料體積對(duì)發(fā)酵耦合泡沫分離生產(chǎn)nisin的影響Fig.4 Effects of different feeding volume on fermentation coupled with foam separation producing nisin

2.5 不同生產(chǎn)工藝對(duì)nisin發(fā)酵的影響

4種不同的發(fā)酵工藝對(duì)發(fā)酵過程的nisin效價(jià)和nisin產(chǎn)量的影響分別見圖5a和圖5b。

圖5 不同發(fā)酵工藝對(duì)nisin生產(chǎn)的影響Fig.5 Effects of different fermentation technologies on nisin production

圖5的結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，補(bǔ)料組在發(fā)酵第12 h至第13 h nisin效價(jià)顯著下降，nisin產(chǎn)量增加緩慢，其主要原因是在發(fā)酵第12 h補(bǔ)料溶液的稀釋作用結(jié)果。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，由于補(bǔ)料促進(jìn)了nisin的合成速率，nisin效價(jià)和產(chǎn)量開始上升，在發(fā)酵的第14 h達(dá)到最高值，這與之前的研究結(jié)果是一致的［19］。

圖5-a和圖5-b的結(jié)果還表明，耦合組(這里包括耦合補(bǔ)料組和耦合不補(bǔ)料組)與對(duì)照組相比，在發(fā)酵時(shí)間第8～9 h內(nèi)nisin效價(jià)和產(chǎn)量同時(shí)下降，這是由于耦合過程中的通氣影響了乳酸乳球菌的生長(zhǎng)，從而使nisin合成受到影響，另外有部分nisin在通氣過程中失活也是造成效價(jià)和產(chǎn)量下降的原因。停止通氣后菌體生長(zhǎng)逐漸恢復(fù)正常且nisin抑制作用被解除，因此nisin效價(jià)和產(chǎn)量在發(fā)酵第9～12 h內(nèi)效價(jià)迅速增加。隨后，由于補(bǔ)料的稀釋作用，耦合補(bǔ)料組的nisin效價(jià)在發(fā)酵第12～13 h內(nèi)明顯降低。此后，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，由于補(bǔ)料促進(jìn)了nisin的合成速率，該組的nisin產(chǎn)量和效價(jià)均大幅提高，最終發(fā)酵末期時(shí)(發(fā)酵第15 h)nisin總效價(jià)(4 813 IU/mL)和產(chǎn)量(3.37×106IU)相對(duì)于對(duì)照組(4 097 IU/mL和2.46×106IU)分別提高了17.5%和37.0%。耦合不補(bǔ)料組的效價(jià)和產(chǎn)量自第13小時(shí)逐步降低，發(fā)酵末期時(shí)該組的效價(jià)和產(chǎn)量分別為3 875 IU/mL和2.33×106IU，較對(duì)照組均降低了5.7%和5.6%。其原因是發(fā)酵后期營養(yǎng)組分的缺乏影響了細(xì)胞生長(zhǎng)，且部分nisin在耦合過程中失活，從而影響了nisin的效價(jià)和產(chǎn)量。

3 結(jié)論

通過正交試驗(yàn)確定了合適的耦合操作條件為氣速40 mL/min，pH 5.75，通氣持續(xù)時(shí)間為90 min。在此條件下，耦合發(fā)酵中nisin的失活率為6.1%，重復(fù)試驗(yàn)，得到nisin的失活率為5.7%。在該條件下的耦合發(fā)酵過程中進(jìn)行補(bǔ)料，結(jié)果表明，該工藝可使反應(yīng)體系中的nisin效價(jià)和產(chǎn)量分別達(dá)到4 813 IU/mL和3.37×106IU，與對(duì)照組相比較分別提高了17.5%和 37.0%。

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