王姣姣，劉 博，赫彩霞，高文惠

（河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，石家莊 050000）

我國是一個飼料生產(chǎn)和消耗大國，然而在飼料的生產(chǎn)、加工、運輸及貯存過程中，飼料霉變的現(xiàn)象屢見不鮮，霉菌毒素對飼料會產(chǎn)生不同程度的污染，造成了巨大的經(jīng)濟損失，已成為飼料業(yè)和畜牧業(yè)生產(chǎn)中不可忽視的問題。據(jù)聯(lián)合國糧食組織估算，全世界每年約有5%～7%的糧食、飼料等農(nóng)產(chǎn)品受到霉菌的污染，因而飼料的防腐保鮮問題尤為重要。

控制飼料霉變的措施很多，Kim等研究了物理防霉。但目前在生產(chǎn)中應(yīng)用最廣的是防霉劑[1]。隨著飼料工業(yè)的快速發(fā)展，飼料防霉劑的應(yīng)用日益廣泛，對飼料行業(yè)的貢獻越來越大，品種也日益增多，因此對飼料防霉劑防霉效果的檢驗成為關(guān)鍵[2-7]。

飼料防霉劑防霉效果的檢測方法有杯碟法、最低抑菌濃度（MIC）法、飼料強化防霉（破壞性試驗）、飼料常規(guī)試驗、二氧化碳稀釋法、溫度測定法、平皿記數(shù)法等。在眾多防霉劑中，丙酸類防霉劑因其成本較低、公認安全、世界通用等特點受到飼料企業(yè)和研究者的青睞[8-10]。本試驗將防霉劑添加到飼料中，通過破壞性實驗法和平皿計數(shù)法研究其對飼料的防霉效果。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

分析天平：上海精科天平，JA2003；電熱恒溫培養(yǎng)箱：中儀國科（北京）科技有限公司，DHP-9082；電熱干燥箱：江蘇省東臺縣電器廠，2002-2型；高壓滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠，SYQDSX-280B；無菌工作臺：北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司，YT-CJ-1N型；試管架、試管（25 mL）、三角瓶（500 mL）、平皿（9 cm）、量筒（25 mL、100 mL）、洗耳球、稱量瓶、燒杯（1 000 mL）、移液槍、槍頭。

培養(yǎng)基為硝酸鈉2 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂（MgSO2·7H2O）0.5 g、氯化鉀0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g、氯化鈉60 g、蔗糖30 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL。上述試劑中瓊脂為生化試劑，其余為分析純試劑。

稀釋液為0.85%生理鹽水：稱取分析純NaCl 8.5 g，定容至1 000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 破壞性試驗

提高飼料含水量為12%、14%、16%，將恒溫培養(yǎng)箱中的濕度調(diào)節(jié)為85%，溫度28℃。

1.2.2 平皿計數(shù)法

將加入不同比例（0、0.4‰、0.6‰）防霉劑的飼料在一定條件下儲存，每隔7 d進行取樣，用稀釋液稀釋、振蕩后將上層液吸取1 mL，與培養(yǎng)基混勻，培養(yǎng)后進行計數(shù)。

1.2.3 試驗分組與編號

在飼料中添加不同量的防霉劑，同時按照試驗要求調(diào)節(jié)飼料中的水分含量，并對樣品進行編號，具體方案見表1。

表1 試驗分組

1.3 操作步驟

1.3.1 培養(yǎng)基與稀釋液的配制

按照GB/T13092—2006用蒸餾水加溫溶解培養(yǎng)基成分，分裝后121℃高壓滅菌30 min。必要時，可酌量增加瓊脂。稱取分析純NaCl 8.5 g，用蒸餾水溶解，定容至1 000 mL，制成稀釋液。按需要量分裝在試管和三角瓶中，121℃高壓滅菌30 min。其他玻璃器具和槍頭在同樣條件下滅菌備用。

1.3.2 感官檢測

觀察飼料的色澤，聞飼料的香氣，并挑起少量飼料觀察形態(tài)。

1.3.3 取樣檢測

將飼料編號后在試驗條件下儲存，每隔7 d進行取樣。以無菌操作稱取有霉菌的飼料25 g，放入含有225 mL滅菌生理鹽水的250 mL三角瓶中，振蕩30 min，即為1：10稀釋液。用移液槍取上述稀釋液1 mL，注入盛有9 mL稀釋液的試管中，充分振蕩，使霉菌孢子分散，完成100倍稀釋。用相同的方法完成1 000倍稀釋。將以上稀釋液用移液槍各取1 mL注入平皿中，倒入適量45℃以下的培養(yǎng)基，充分混勻，待其凝固后，倒置放入恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，3 d后開始觀察，培養(yǎng)觀察1周。

1.3.4 水分含量測定

稱取飼料2.000 g放入稱量瓶，在103±2℃的干燥箱中烘干3 h，取出在干燥器中冷卻至室溫后稱量，再放入干燥箱中干燥30 min，取出后冷卻稱量，兩次稱量值相差＜0.002 g視為恒重，計算水分含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用OriginPro8軟件根據(jù)數(shù)據(jù)作圖，觀察儲存期內(nèi)霉菌數(shù)的變化以及飼料水分含量的變化趨勢和規(guī)律。

2 試驗結(jié)果

2.1 感官檢驗

儲存7 d后取出，1～9號樣品在色澤、氣味和組織方面無明顯變化。儲存14 d后取出，1～2號以及4～9號樣品色澤變淺變暗，氣味減弱，組織方面無變化，3號樣品色澤變暗，稍有霉味兒，大量結(jié)塊。儲存21 d后，2號少量結(jié)塊，3號長出肉眼可見的少量霉菌，6號微量結(jié)塊。其他樣品組織方面無變化，色澤變暗，氣味減弱，無異味。儲存35 d后，1號、5號、6號少量結(jié)塊，2號大量結(jié)塊，3號長出大量霉菌，4號、7號、8號、9號無變化。

2.2 霉菌檢測數(shù)

儲存之前用平皿計數(shù)法測量飼料原樣品的霉菌數(shù)，之后每隔7 d測量1次，到達21 d后隔14 d測量1次，隨著天數(shù)的增加，飼料中霉菌數(shù)逐漸增加，測量結(jié)果見表2。

表2 飼料儲存試驗霉菌檢測數(shù)

由表2可以看出，加入防霉劑0～7 d，霉菌數(shù)有所下降。由此可見，此種防霉劑具有一定的殺菌作用；3號和6號樣品在14～21 d中霉菌數(shù)增長速度加快，其他樣品在21～35 d時霉菌數(shù)增長速度也加快。

2.3 水分含量

試驗中測量霉菌數(shù)的同時，對飼料的水分含量也進行了測量，數(shù)據(jù)記錄結(jié)果見表3。

表3 飼料儲存試驗水分含量的測定 %

由表3可知，飼料儲存過程中，水分含量一般先上升再下降然后第2次上升。

3 討 論

3.1 試驗方法的選擇

破壞性試驗旨在提高飼料水分含量，惡化環(huán)境（高溫、高濕）從而促使飼料盡快發(fā)霉。這種方法作為防霉劑性能評判的中期試驗，試驗結(jié)果較直觀，在較短時期內(nèi)（10～20 d）即能得出防霉效果；對各種飼料防霉劑的評價普遍適用。何萬領(lǐng)等在試驗中調(diào)節(jié)試驗材料的水分含量并放入26℃的恒溫箱中儲存，得出較理想的試驗結(jié)果[11]。缺點是試驗時間仍然較長，對防霉性能相近的防霉劑測定結(jié)果不夠準(zhǔn)確[12]。

平皿記數(shù)法根據(jù)霉菌生理特性和防霉劑防霉機理，選擇適宜霉菌生長而不適宜細菌生長的培養(yǎng)基，采用平皿記數(shù)法，在菌液中加入防霉劑，培養(yǎng)后測定霉菌菌落總數(shù)，菌落總數(shù)越少，表明其防霉抑菌效果越佳，并根據(jù)測定的數(shù)據(jù)計算出防霉劑的抑菌率。周永紅等在防霉劑效果檢測中使用了此種方法，并根據(jù)測定的數(shù)據(jù)計算出各種防霉劑的抑菌率，操作方便，結(jié)果準(zhǔn)確[13]。

本試驗綜合以上兩種試驗方法，將培養(yǎng)箱的溫度調(diào)為霉菌的最適生長溫度，即25～28℃，將濕度調(diào)為85%，在盡量縮短試驗時間的基礎(chǔ)上保證了試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.2 感觀檢測

由感官檢測結(jié)果可知，在高溫、高濕的儲存環(huán)境中，飼料的色澤首先會發(fā)生變化，氣味減弱，隨著時間的推移會少量結(jié)塊，此時，飼料已經(jīng)變質(zhì)，商品及食用價值消失。繼續(xù)儲存，飼料表面會長出肉眼可見的霉菌，發(fā)生腐敗。根據(jù)儲存期內(nèi)霉菌數(shù)檢測結(jié)果可知，對水分含量相同、防霉劑添加量不同以及防霉劑添加量相同、水分含量不同的飼料進行直觀的比較，在儲存期的后期，防霉劑的防霉作用不顯著；3號和6號樣品水分含量相同，防霉劑添加量不同，但最終霉菌數(shù)相似，因此，當(dāng)飼料的水分含量在16%時，防霉劑作用不顯著，此時應(yīng)大幅度提高防霉劑的添加量，以達到防霉效果。綜合感官檢驗結(jié)果，在水分含量第2次上升時飼料發(fā)生霉變；加入防霉劑的飼料水分含量下降較慢，可見，此種防霉劑具有一定的保水作用，可防止水分遷移。

試驗過程中發(fā)現(xiàn)檢測霉菌數(shù)量時采用混勻法，稀釋液對培養(yǎng)基起一定的稀釋作用，所以瓊脂的用量應(yīng)酌量增加。由于所檢樣品數(shù)量較多，在平皿中傾倒培養(yǎng)基時所用時間盡量短，避免凝固。傾倒溫度＜45℃，避免影響試驗結(jié)果。

4 結(jié)論

飼料本身的水分含量對防霉劑的效果有一定的影響，當(dāng)水分含量較高時，防霉劑的防霉效果不顯著。試驗結(jié)果表明，此種防霉劑具有一定的殺菌作用，同時具有一定的保水作用。綜合感官檢驗結(jié)果，在水分含量第2次上升時飼料發(fā)生霉變，根據(jù)這個規(guī)律可以通過測量飼料的水分含量來預(yù)期飼料發(fā)霉變質(zhì)的時間和階段。

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