周鵬，余清，林欽，戴明，鄭小嚴(yán)

（1.福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院，福建福州350002；2.南京理工大學(xué)化工學(xué)院，江蘇南京210094）

辣椒紅色素是以辣椒為原料，經(jīng)過提取、分離、精制而成的天然色素，其主要功能成分為辣椒紅素和辣椒玉紅素，而其中脂肪酸含量占80%～85%。它具有色澤鮮艷，著色力強，耐光、熱、酸、堿，且不受金屬離子影響；該產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)品、肉類、糕點、色拉、罐頭、飲料等各類食品和醫(yī)藥的著色[1]。

由于辣椒紅色素從天然辣椒中提取，成本相對較高，少部分不法商販為了降低生產(chǎn)成本提升產(chǎn)品的著色效果，在產(chǎn)品中非法添加禁用物質(zhì)羅丹明B。由于羅丹明類染料具有潛在的致癌和致突變性，中國衛(wèi)生部已經(jīng)將羅丹明B列在《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單（第一批）》[2]中，禁止在食品及食品相關(guān)產(chǎn)品中使用。目前對于羅丹明B的分析方法主要有液相色譜法[3]、液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法[4－5]，因液相色譜串－聯(lián)質(zhì)譜法具有優(yōu)越的定性定量能力，極高的靈敏度以及抗干擾能力，逐漸成為非法添加物分析鑒定的主要手段。由于辣椒紅色素是天然提取物，組分復(fù)雜，并且含有大量的油脂，現(xiàn)有的分析方法不能滿足該類樣品的分析測試需要，給不法分子留有可乘之機。因此，急需發(fā)展一種能夠快速、準(zhǔn)確、高靈敏的方法檢測辣椒紅色素中羅丹明B的含量。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

1.1.1 試劑與材料

羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)品：純度大于95%（德國Dr.公司）；甲醇、乙腈、正己烷、環(huán)己烷、乙酸乙酯均為色譜純（美國Merck公司）；甲酸：優(yōu)級純（美國Merck公司）。中性氧化鋁：柱層析用，100目～200目（國藥集團）；堿性染料專用小柱：60 mg/3cc（福州藍(lán)昊生物醫(yī)藥有限公司）；濾膜：0.22 μm尼龍濾膜（津騰公司），實驗樣品為市售樣品。

1.1.2 儀器

液質(zhì)聯(lián)用儀：液相部分 Agilent 1290，質(zhì)譜部分Agilent 6460三重四級桿質(zhì)譜儀，均為美國安捷倫科技公司；Avanti J－E冷凍高速離心機：美國貝克曼公司；DS－8510 DTH：超聲波清洗機。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液及試劑的配制

標(biāo)準(zhǔn)品的配制：準(zhǔn)確稱取0.0526g羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)品于100mL容量瓶中，用甲醇溶解定容作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液。準(zhǔn)確移取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用空白提取液稀釋成0.50 μg/mL～102.20μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列；酸化甲醇：取200 mL超純水加入20mL甲酸，用甲醇定容至1000mL，配制成80%酸化甲醇（含2%甲酸）；甲醇飽和正己烷：取100mL甲醇加入400mL正己烷，劇烈振搖混合后靜置分層，上層即為甲醇飽和正己烷；0.3%甲酸水溶液：準(zhǔn)確移取3.0 mL甲酸溶液，用超純水稀釋定容至1000mL。

1.2.2 樣品前處理方法

稱取約5.0 g試樣于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入20.0 mL酸化甲醇，振搖混勻后置于超聲波清洗機中超聲提取30 min，超聲過程中每隔10分鐘振搖一次。超聲結(jié)束后置于離心機中4℃下15 000 r/min離心5 min，取上層清液約2 mL于10 mL刻度試管中，加入約2 mL乙腈飽和正己烷渦旋2 min，靜置分層，取下層液體于2 mL離心管中，置于離心機中，4℃下20 000 r/min離心5 min，取下層清液過尼龍濾膜，棄去前面約1 mL溶液，后1 mL溶液過濾至進(jìn)樣小瓶中上機測試。

1.3 色譜質(zhì)譜條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Waters BEH C182.1×50 mm 1.7 μm；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：2.0 μL；流動相 A：0.3%甲酸水，流動相B：乙腈；流速：0.3 mL/min；梯度洗脫程序為：0～3min，10%B→80%B；3 min～4 min，80%B；4.01 min ～ 5 min，10%B。

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子模式；監(jiān)測模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；脫溶劑氣溫度：350 ℃；脫溶劑氣流速：5 L/min；霧化氣壓力：55 psi；鞘氣溫度：400 ℃；鞘氣流速：12 L/min；毛細(xì)管電壓：4500 V；噴嘴電壓：0 V；采用多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM），監(jiān)測離子對為：443/399、443/355，定量離子對為 443/399。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜及質(zhì)譜條件的選擇

在實驗過程中我們分別比較了不同流動相對峰形的影響，其中流動相的pH對羅丹明B的峰形及響應(yīng)影響比較大。當(dāng)流動相中不添加甲酸時，峰變形嚴(yán)重，不能正常辨識哪個峰是羅丹明B，當(dāng)流動相中添加適量甲酸后，峰形變得尖銳且響應(yīng)迅速增大，當(dāng)水相中的甲酸濃度在0.2%至0.5%之間時，峰形良好，且響應(yīng)也較為穩(wěn)定，因此我們采用0.3%甲酸水溶液作為水相。這說明了流動相中添加適量甲酸不僅有利于羅丹明B的離子化，而且有利于改善其在C18柱上的保留。

取濃度為5.0 mg/L的羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液，不經(jīng)過色譜柱的分離，直接進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行條件優(yōu)化。主要對離子源參數(shù)中的脫溶劑氣溫度、脫溶劑氣流速、霧化氣壓力、鞘氣溫度、鞘氣流速、毛細(xì)管電壓、噴嘴電壓等參數(shù)以及多反應(yīng)監(jiān)測條件中的毛細(xì)管電壓、碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。

2.2 樣品的提取與凈化

2.2.1 提取與凈化方法的選擇

試驗中比較了酸化甲醇提取正己烷凈化、乙酸乙酯環(huán)己烷溶解GPC凈化、以及正己烷溶解中性氧化鋁小柱凈化、酸化乙腈提取堿性染料專用小柱凈化法等處理方法。GPC凈化法由于羅丹明B無法與油脂正常分離，回收率很低，并且羅丹明B的極性較強，在乙酸乙酯正己烷溶液中溶解度低，當(dāng)試樣濃度高時，回收率也較低。采用由于中性氧化鋁的活度不易控制，導(dǎo)致采用中性氧化鋁小柱凈化回收率不穩(wěn)定。采用酸化乙腈提取堿性染料專用小柱凈化法由于提取液中含油量較高，加水稀釋后乳化現(xiàn)象嚴(yán)重，導(dǎo)致過堿性染料專用小柱凈化時小柱堵塞嚴(yán)重，回收率較低。

綜合以上實驗結(jié)果分析，采用酸化甲醇提取正己烷凈化方法簡單、處理時間短、實驗結(jié)果穩(wěn)定可靠，適合質(zhì)檢類實驗室進(jìn)行大批量樣品的處理，因此本實驗采用該方法為樣品處理方法。

2.2.2 提取與凈化方法的優(yōu)化

由于羅丹明B在甲醇、乙腈中的溶解度較好，因此我們首先研究了不同濃度的甲醇或乙腈對提取效率的影響，如圖1所示。

分析結(jié)果表明：80%甲醇的提取效率最高，并且當(dāng)有機溶劑比例低于80%時，提取液乳化現(xiàn)象明顯，且有機溶劑比例越低，乳化越嚴(yán)重，即使經(jīng)乙腈飽和正己烷凈化，20 000 r/min離心后也很難破乳，也可能影響到回收率。因此，我們選用80%甲醇為提取溶劑。

羅丹明B是屬于堿性染料，提取液的pH對其提取效果有較大的影響，我們在80%甲醇中分別加入不同比例的甲酸溶液，對加標(biāo)樣品進(jìn)行分析測試，如圖2所示。

實驗結(jié)果表明：pH對提取效率的影響較大，當(dāng)甲酸濃度超過2%以后，峰面積變化不大，因此我們采用80%甲醇溶液中加入2%甲酸作為提取溶劑。

根據(jù)以往的實驗經(jīng)驗，很多色素、染料尤其是堿性染料與濾膜的作用比較明顯，在過濾過程中會被濾膜所吸附，造成含量下降。因此，我們采用過濾標(biāo)準(zhǔn)溶液的方式，嘗試了3種常用于過濾有機溶液的濾膜，分別為：尼龍濾膜、PVDF濾膜及PTFE濾膜，考察它們對羅丹明B的吸附作用。實驗結(jié)果表明：過不同濾膜過濾后，峰面積變化明顯，其中過尼龍濾膜回收率為84.6%，過PTFE濾膜回收率為79.5%，過PVDF濾膜回收率為11.5%。這說明了3種濾膜對羅丹明B均具有較為明顯的吸附作用，尤其是PVDF濾膜，吸附量接近90%，這將嚴(yán)重影響到分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。

為了降低濾膜對羅丹明B吸附所造成的影響，在過濾時先棄去約1 mL的濾液后再收集剩下的濾液，降低濾膜對羅丹明B吸附的影響。實驗結(jié)果表明：先棄去1 mL濾液后，收集到的樣品含量均有明顯提升，其中尼龍膜回收率達(dá)98.9%，PTFE濾膜回收率接近100%，PVDF濾膜達(dá)82.8%，分別比先前直接過濾收集濾液的方法提高回收率達(dá)14.3%、20.5%、71.3%，考慮到液質(zhì)聯(lián)用儀定量允許的誤差，尼龍濾膜及PTFE濾膜均能滿足實驗要求，雖然PVDF濾膜回收率提高幅度最大，但是由于其吸附容量較大，經(jīng)過該方法處理后回收率還是偏低，不適合在本實驗中使用。同時，為了降低試驗成本，本實驗后續(xù)的濾膜均采用了尼龍濾膜。

2.3 分析方法確證

2.3.1 目標(biāo)化合物的確認(rèn)

實驗對羅丹明B的離子產(chǎn)生機理進(jìn)行初步研究，羅丹明B的相對分子量為479.0，脫去氯離子后形成m/z=443.0的母離子，將母離子進(jìn)一步碰撞碎裂，產(chǎn)生二級質(zhì)譜圖，見圖3，其可能的裂解規(guī)律見圖4。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢測限

分別配置濃度為 0.50 μg/L～102.20 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，作出羅丹明B的線性方程為：Y=1055.7952X－7.243 8，R2=0.999 4。

以0.50 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)樣品來計算，其信噪比達(dá)到36.8，以 S/N＞10 計，定量限＜1.0 μg/kg，完全可以滿足檢測定量要求。

2.3.3 回收率和重現(xiàn)性

在空白樣品中分別添加 0.5、2.5、5.0 μg/kg 3 個水平的加標(biāo)測試，每個水平進(jìn)行6個平行樣品試驗，樣品回收率為86.7%～96.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.4%～3.4%。

2.4 實際樣品的分析

從市場購買80個不同產(chǎn)地、不同規(guī)格的樣品進(jìn)行測試，僅檢出兩個陽性樣品，含量分別為12 μg/kg和45 μg/kg，整體產(chǎn)品質(zhì)量狀況較好。由于檢出含量較低人為添加可能性較低，因辣椒紅色素生產(chǎn)過程中濃縮倍數(shù)較高，可能是由于樣品被污染而帶入。

3 結(jié)論

本文采用酸化甲醇溶液提取、甲醇飽和正己烷凈化、高效液相色譜分離和串聯(lián)四級桿質(zhì)譜檢測，成功建立了辣椒紅色素中羅丹明B含量的測定方法。該方法處理簡便、快速、靈敏度高，適用于大批量樣品的檢測。

[1] 陳丹,吳贊敏,張昊.天然染料辣椒色素的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和應(yīng)用[J].整染技術(shù),2010,32(4):39－41

[2]中華人民共和國衛(wèi)生部.食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單（第一批）.http：//www.moh.gov.cn/publicfiles/business/htmlfiles/mohwsjdj/s3594/200812/38511.htm

[3] 劉敏,李小林,別瑋,等.故鄉(xiāng)萃取－高效液相色譜法同時測定調(diào)味品中15種工業(yè)合成染料[J].色譜,2011,29(2):162－167

[4] 程慧,李兵,占春瑞.臘腸中羅丹明B的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法[J].食品科學(xué),2010,31(4):233－225

[5] 胡俠,肖光,潘煒,等.高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定辣椒粉及辣椒油中的7種羅丹明染料[J].色譜,2010,25(6):590－595