郭麗梅，王盼盼

(天津科技大學(xué)材料科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，天津 300457)

黃酮類化合物是一類廣泛存在于植物中的天然植物成分，為植物多酚類的代謝物，大多有顏色，其相對(duì)分子質(zhì)量較低且具有多種生理活性，如抗氧化、抗自由基、抗癌、抗炎、抗病毒和降血糖等[1–2]．黃酮類化合物對(duì)高血壓引起的頭痛、項(xiàng)強(qiáng)、頭暈、耳鳴等癥狀有明顯的療效[1]．黃酮在板栗花粉中含量較高[3]，是板栗花粉中值得研究的一類具有生物活性的化合物[4–6]．常用的提取黃酮的方法為醇提法[7]．分析黃酮的方法主要有分光光度法、氣相色譜法、高效液相色譜法、薄層色譜法等[8–13]．其中分光光度法操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)較少，可用于總黃酮的檢測(cè)．液相色譜質(zhì)譜法分離效率高，分析速度快，檢測(cè)靈敏度高，可用于黃酮種類及黃酮含量的檢測(cè)．

本研究采用板栗花粉作為原料，采用醇提法對(duì)其中的黃酮進(jìn)行了提取，并采用分光光度法檢測(cè)總黃酮的含量，用高效液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)提取的黃酮進(jìn)行定性檢測(cè)，為板栗花粉黃酮的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 原料、試劑及儀器

板栗花粉，承德暢達(dá)天然營(yíng)養(yǎng)品有限公司；AB–8大孔樹脂，南開大學(xué)化工廠；乙醇、乙腈、超純水等試劑，天津北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；蘆丁、楊梅黃酮、槲皮素等標(biāo)準(zhǔn)品，南京替斯艾么中藥研究所．

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；VIS–723G可見分光光度計(jì)，北京福利儀器分析公司；Waters 3100液質(zhì)聯(lián)用儀，美國(guó)Waters公司．

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樹脂的預(yù)處理

先用95%乙醇浸泡12,h，然后用蒸餾水洗至無醇味，再用 4%鹽酸溶液浸泡 12,h，用蒸餾水洗至中性后，用 4%NaOH溶液浸泡 12,h，用蒸餾水洗至中性，置于4,℃冰箱備用．

1.2.2 黃酮提取工藝[14]

取破壁板栗花粉 5,g置于四口燒瓶中，加入50,mL 70%乙醇溶液，70,℃水浴加熱提取1.5,h，過濾得濾液Ⅰ．重復(fù)提取 1次得濾液Ⅱ，合并濾液得到黃酮粗提液．

1.2.3 純化工藝

取 20,mL預(yù)處理好的大孔樹脂裝柱，取 10,mL粗提液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用4,mL 70%乙醇進(jìn)行溶解，濕法上樣，用 200,mL蒸餾水淋洗，然后依次用 140,mL體積分?jǐn)?shù)分別為 60%、70%、80%的乙醇淋洗[15]，流量為1,mL/min，收集乙醇部分，得到乙醇洗脫液．

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液：稱量 120,℃下烘干的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.025,0,g，用 95%乙醇溶解，定容于 50,mL容量瓶中，質(zhì)量濃度為0.5,mg/mL．

取 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0,mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液于 25,mL容量瓶中，加水 6,mL后再加入 5%的亞硝酸鈉溶液 1,mL，搖勻，靜置 6,min；加入 10%的Al(NO3)3溶液1,mL，搖勻，靜置6,min；再加入4%的NaOH 溶液 10,mL，加水定容，搖勻，靜置 15,min；4,000,r/min離心10,min，以不含蘆丁的空白溶液為參比溶液，采用可見分光光度法在波長(zhǎng) 510,nm 處測(cè)定吸光度，以質(zhì)量濃度與吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[15]．

將提取液在相同的方法下測(cè)定吸光度(A)．由回歸方程算出總黃酮類化合物質(zhì)量濃度．取 40,mL的黃酮粗提液或者乙醇洗脫液蒸干，計(jì)算旋蒸瓶前后的質(zhì)量差(m)，蒸干后固體中總黃酮含量(P)按照式(1)計(jì)算：

1.2.5 液相色譜–質(zhì)譜分析

色譜條件：Waters 3100高效液相色譜儀，PDA 2998檢測(cè)器，Waters 2767收集和進(jìn)樣系統(tǒng)，Waters symmetry C18色譜柱(5,μm，150,mm×4.6,mm)，流動(dòng)相A為0.1%的甲酸水溶液，流動(dòng)相B為0.1%的甲酸乙腈溶液，流量為 1,mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為 280、350,nm，流動(dòng)相的洗脫程序見表1．

質(zhì)譜參數(shù)：毛細(xì)管電壓3.00,kV，離子源溫度110,℃，錐孔電壓30,V，抽取器電壓3,V，去溶劑化溫度 300,℃，載氣為高純氮?dú)?，脫溶劑氣流流?50,L/h，反吹氣流量 50,L/h．電離方式為電噴霧(ESI)，正離子掃描模式，掃描范圍質(zhì)荷比(m/e)為85～1,500．

表1 梯度淋洗程序Tab.1 Process of gradient elution

2 結(jié)果與分析

2.1 提取物中總黃酮含量

按 1.2.4方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為A＝9.416,5,X－0.008,8，R2＝0.999,6．不同濃度乙醇淋洗所得總黃酮的含量見表2．

表2 不同濃度乙醇淋洗所得總黃酮的含量Tab.2 Content of flavonoids and ethanol concentrations in elution

由表2可知，粗提液中黃酮的含量為13.39%，使用大孔樹脂純化后，總黃酮含量均有提高，較佳的洗脫液濃度為 70%乙醇，將 70%乙醇的洗脫液濃縮，重復(fù)純化兩次，得到黃酮含量為 78.12%的液相色譜-質(zhì)譜待測(cè)液．

2.2 液相色譜–質(zhì)譜檢測(cè)黃酮種類

黃酮類物質(zhì)在 280、350,nm 左右為典型吸收峰，因此同時(shí)出現(xiàn)在兩個(gè)波長(zhǎng)下的峰為黃酮峰，其他峰為雜質(zhì)峰，將待測(cè)液在1.2.5液質(zhì)條件下分析(圖1)．從圖 1可以看出，黃酮峰的保留時(shí)間為 6.63、6.97、7.43、7.87、8.25、8.50,min(取 350,nm 下的保留時(shí)間)．雜質(zhì)在 280,nm 下有較強(qiáng)的干擾作用，相比于350,nm的譜圖，該波長(zhǎng)下各峰的分離情況較差．

黃酮類物質(zhì)在正離子模式中通常表現(xiàn)出加氫峰[M＋H]+，加鉀峰[M＋K]+或者加鈉峰[M＋Na]+的形式，并且在 ESI電離方式得到的譜圖為一級(jí)質(zhì)譜圖，通常產(chǎn)生較大的碎片離子和分子離子峰，可從譜圖中 找到各物質(zhì)相應(yīng)的分子離子峰．

圖1 待測(cè)液的液相色譜圖Fig.1 HPLC of the extraction

依據(jù)參考文獻(xiàn)[16–18]，總結(jié)出板栗花粉中可能存在的黃酮種類見表3．

通過表3可以看出，板栗花粉中可能存在的黃酮有 6種，不考慮黃酮與其他物質(zhì)的結(jié)合，花粉中檢測(cè)到的黃酮為槲皮素、山奈酚、異鼠李素以及楊梅黃酮4種．為了進(jìn)一步確定4種黃酮的存在，將4種黃酮的標(biāo)準(zhǔn)品在相同的質(zhì)譜條件下檢測(cè)，得到的標(biāo)準(zhǔn)譜圖與樣品譜圖中的離子峰進(jìn)行比較，結(jié)果見表4．

表3 板栗花粉中可能存在的黃酮及分析Tab.3 The kinds and analysis of flavonoids contained in chestnut pollen

表4 標(biāo)準(zhǔn)品在質(zhì)譜中的行為及與樣品質(zhì)譜圖對(duì)照Tab.4 The behavior of standard substance and the samples

由表4可以初步斷定，板栗花粉中可能存在的黃酮為山奈酚、槲皮素、異鼠李素以及楊梅黃酮等．

3 結(jié) 論

經(jīng)液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用儀的檢測(cè)，初步可斷定板栗花粉中含有的黃酮種類主要為山奈酚、槲皮素、異鼠李素以及楊梅黃酮，存在的形式多為游離態(tài)與葡萄糖、鼠李糖等糖的結(jié)合．粗提液經(jīng)過大孔樹脂純化后總黃酮的含量由 13.39%提高到 78.12%，較佳的洗脫體系可選為200,mL蒸餾水和140,mL 70%乙醇，依次洗脫，流量為1,mL/min．

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