黃冬蘭，陳小康，徐永群，梁俊發(fā)

（韶關學院 化學與環(huán)境工程學院，廣東 韶關512005）

溪黃草Rabdosia serra(Maxim)Hara屬于唇形香茶菜屬植物，為民間習用草藥，多用于清熱利濕、涼血散淤和治急性黃疸肝炎、急性膽囊炎等癥，并被用作成藥消炎利膽片、膽石通膠囊及復方膽通膠囊的原料之一.研究發(fā)現(xiàn)，溪黃草含有萜類、黃酮類、酚類、氨基酸等活性成分［1］.其中，黃酮類為一類生物活性較強的成分，具有抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗?jié)儭⒔笛?、抗心律失常、抑制表皮黑色素生成、防止皮膚癌等功效［2-3］.黃酮類化合物因其藥效顯著且副作用極小，已成為科研工作者研究的熱點之一.

目前，黃酮類化合物的提取方法主要有：微波輔助提取法、有機溶劑提取法、超臨界流體萃取法、酶輔助提取法、超聲輔助提取法等［4］.其中，微波輔助提取法因其具有效率高、選擇性強、萃取時間短、溶劑用量少、污染小等優(yōu)點，已被廣泛地應用于黃酮類化合物提取工藝研究中［5-8］.本文作者采用單因素法和正交試驗法對溪黃草中總黃酮的微波提取工藝條件進行了研究，旨在建立快速提取溪黃草中總黃酮的生產(chǎn)工藝，為開發(fā)利用溪黃草藥材提供參考.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器：722S分光光度計 （上海棱光技術有限公司）；KJ23C-AN2微波爐 （廣東美的微波爐制造有限公司）；AUY-220分析天平（島津國際貿(mào)易（上海）有限公司）；878B粉碎機（江蘇省金壇市通濟儀器廠）.

試劑：蘆丁標準品，中國藥品生物制品檢定所；無水乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉，分析純；實驗用水為去離子水.

1.2 樣品的前處理

1.2.1 樣品的取樣和洗滌：溪黃草樣品采于韶關市翁源縣，用清水漂洗干凈后，再用蒸餾水洗3次，置于60℃烘箱中干燥12 h，烘干至恒重，粉碎后過20目篩，于干燥器中保存?zhèn)溆?

1.2.2 樣品的提取與試液制備：準確稱取上述備用樣品1.000 0 g，置于微波消解罐中，加入適量一定濃度的乙醇溶液，放在微波爐中加熱提取，冷卻后過濾，收集濾液，然后用相應濃度的乙醇溶液定容至50 mL，冷藏備用.

1.3 分析方法

1.3.1 標準曲線的繪制

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁分光光度法.精密量取蘆丁標準溶液(ρ=0.208 mg/mL)0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL，分別置于50 mL比色管中，加入1.00 mL 5%亞硝酸鈉溶液，混勻，靜置6 min，加入1.00 mL 10%硝酸鋁溶液，迅速振蕩混勻，靜置6 min，再加入10.00 mL 4%氫氧化鈉試液，搖勻后加65%乙醇溶液定容，搖勻，放置15 min.以試劑空白作參比，用1 cm比色皿在510 nm波長處測定吸光度.以質量（mg）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標繪制標準曲線.

1.3.2 總黃酮含量測定

取1.00 mL溪黃草試液于25 mL比色管中，以下操作同1.3.1，測定其在510 nm處吸光度，根據(jù)標準曲線，計算總黃酮含量.

2 結果與討論

2.1 單因素考察

2.1.1 乙醇濃度的確定

固定料液比為1∶20，微波功率為中高火，微波萃取時間為4 min，考察了乙醇濃度分別為65%、70%、75%、80%時溪黃草總黃酮的提取率.測定結果如圖1所示，結果表明：當乙醇濃度為70%時，溪黃草總黃酮的提取率最高.但乙醇濃度為65%時，總黃酮的提取率已達0.53%，與用70%乙醇溶液所得的提取率0.55%差別不大，為減少乙醇溶劑用量，倡導綠色化學理念，選取乙醇溶劑的濃度為65%.

圖1 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響

2.1.2 料液比的確定

在固定溶劑乙醇的濃度為65%，微波功率為中高火，微波萃取時間為4 min的條件下，通過改變料液比（溪黃草質量∶65%乙醇的體積，g/mL）=1∶10、1∶15、1∶20 和 1∶25，測得料液比對總黃酮提取率的影響，結果如圖2所示.實驗結果表明：當料液比為1∶15時，溪黃草中總黃酮提取率最高.

2.1.3 微波時間的確定

在固定溶劑乙醇的濃度為65%，微波功率為中高火，料液比為1∶15（g/mL）的條件下，通過改變微波時間來探討微波提取時間對總黃酮提取率的影響.本實驗對微波時間分別為2、3、4、5、6、7 min進行了考察，實驗結果表明：當微波時間為6 min，提取溪黃草總黃酮明顯優(yōu)于其他幾組的提取效果，但當微波時間達到4 min后提取率上升不明顯（見圖3），基于成本考慮，選取微波時間為4 min.

圖2 料液比對總黃酮提取率的影響

圖3 微波時間對總黃酮提取率的影響

2.1.4 微波功率的確定

在固定料液比為1∶15（g/mL），微波萃取時間為4 min的條件下，通過改變微波功率來探討微波功率對溪黃草總黃酮提取率的影響.本實驗對微波功率為低火、中低火、中火、中高火和高火進行了考察，結果表明：微波功率為中火時總黃酮的提取率最高（見圖4）.當微波功率高于中火時提取率反而降低.可能是由于微波功率太大，水分子吸收的微波能量過高，在植物細胞內(nèi)形成的內(nèi)熱源過于強烈，導致細胞壁破裂后溶劑分子迅速蒸發(fā)，總黃酮等有效成分來不及從細胞中流出來進入溶劑中［9］.微波功率過小，則微波作用發(fā)揮不完全，總黃酮不能完全提取到溶劑中，使提取率降低.

圖4 微波功率對總黃酮提取率的影響

2.2 正交試驗確定最佳提取工藝

為了確定各因素間的相互作用對總黃酮提取效果的影響，在上述單因素試驗的基礎上，選定4因子3水平進行正交試驗，因素水平見表1，正交試驗結果見表2.

表1 正交試驗因素水平表

表2 正交試驗測定結果

由表1和表2可以看出，四因素對總黃酮提取率的影響依次為：微波時間〉料液比〉乙醇濃度〉微波功率.從各水平的總提取率來看，最優(yōu)組合為A1B1C2D3，即微波功率為中火，微波時間為4 min，乙醇濃度為70%，料液比為1∶20，在此最佳條件下，溪黃草中總黃酮的提取率為1.15%.

3 結論

本研究采用單因素法和正交試驗法對溪黃草中總黃酮的微波提取工藝條件進行了優(yōu)化.確定其最佳提取條件為：微波功率為中火，微波時間為4 min，乙醇濃度為70%，料液比為1∶20.經(jīng)試驗驗證，在此最佳條件下，溪黃草中總黃酮的提取率為1.15%.微波輔助提取法具有提取效率高、選擇性強、節(jié)省時間、節(jié)省溶劑、方法簡便等優(yōu)點.由此可知微波輔助提取法在提取溪黃草中總黃酮方面有明顯的優(yōu)勢，具有廣闊的應用前景.

［1］吳劍峰.溪黃草的研究綜述［J］.時珍國醫(yī)國藥,2003,14(8):498-500.

［2］賈國惠,賈世山.甘草中黃酮的藥理作用研究進展［J］.中國藥學雜志,1998,33(9):513-515.

［3］季宇彬,姜薇,范玉玲,等.甘草黃酮的研究進展［J］.中草藥,2004,35(9):5-6.

［4］佟永薇.黃酮類化合物提取方法的研究及展望［J］.食品研究與開發(fā).2008,29(7):188-190.

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［7］向昌國,向寧,黃成龍,等.響應面法優(yōu)化刺槐花黃酮類化合物的微波提取工藝［J］.2011,32(22):32-36.

［8］陳金娥,匡強民,張海容.正交優(yōu)化-微波輔助提取銀杏葉黃酮［J］.2011,28(2):623-626.

［9］劉艷芳,安廣杰.微波輔助提取夏枯草中熊果酸的工藝［J］.安徽農(nóng)業(yè)科技,2007,35(34):941-942.