潘 越，陳 輝，馮志勇，*，陳明杰，汪 虹，張津京

（1.南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，南京210095；2.國家食用菌工程技術研究中心，農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點開放實驗室，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點開發(fā)實驗室，上海市農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所，上海201403）

斑玉蕈（Hypsizygus marmoreus）又名真姬菇、蟹味菇、鴻喜菇等，隸屬白蘑科玉蕈屬，是重要的工廠化食用菌之一[1]。斑玉蕈味道鮮美，是一種珍稀食用菌品種，在國內外都受到食用菌生產(chǎn)行業(yè)的重視，其在日本、韓國和國內上海等地已經(jīng)實現(xiàn)了工廠化生產(chǎn)模式，且效益良好。近年來，隨著食用菌市場競爭的日趨激烈，假劣菌種充斥著市場，極大地影響了整個產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。為保護我國食用菌物種的遺傳資源，迫切需要簡便、可靠的方法研究斑玉蕈菌株種質資源的遺傳多樣性。

在對真菌rDNA的研究中，通常認為IGS2序列是高變區(qū)，該序列變異性大，進化較快，可用于真菌種間和種內遺傳多樣性研究。Saito等[2]對16個香菇商業(yè)栽培菌株的IGS2序列進行過研究，表明香菇種內菌株間IGS2序列有著顯著的差異。在國內，黃晨陽等[3]對8個刺芹側耳菌株的IGS2序列進行研究，研究顯示刺芹側耳不同菌株的IGS2序列有豐富的多樣性。

RAPD技術是1990年由Williams首先報道的一種分子標記技術[4]，如今已經(jīng)成為生物種內變種和種群差異性研究的通用手段和標記。它具有操作簡單、多態(tài)性高、DNA用量少、信息量大等優(yōu)點。這一方法已經(jīng)廣泛應用于草菇[5]、松口蘑[6]、雙孢蘑菇[7]、木耳[8]、杏鮑菇[9]等主要食用菌的菌種資源研究中。在斑玉蕈中，許占伍等[10]使用RAPD技術成功分析了斑玉蕈單核菌株的遺傳多態(tài)性，為斑玉蕈育種材料的選擇提供了一定的分子水平依據(jù)。

本文擬利用IGS2和RAPD分子標記技術，以20個不同的斑玉蕈菌株為實驗材料，探討各菌株間的親緣關系，旨在為斑玉蕈菌株的快速準確鑒別提供技術依據(jù)，為斑玉蕈種質資源的知識產(chǎn)權保護奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本實驗中斑玉蕈菌株共20份 具體來源見表1；感受態(tài)細胞 Tiangen公司；PCR試劑、pGEM-T載體TaKaRa公司；Axy Prep DNA試劑盒 愛思進生物技術有限公司；IGS2引物 由上海捷瑞生物工程有限公司合成；RAPD隨機引物 由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 供試菌株Table 1 Tested strains of Hypsizygus marmoreus

5810R型高速冷凍離心機 Eppendorf；PCR擴增儀，Power PAC 3000水平電泳儀，VDS凝膠成像系統(tǒng)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取 將低溫保藏的斑玉蕈菌種活化后接種于PDA平板上，25℃暗室培養(yǎng)15～18d，收集菌絲。采用CTAB法[11]提取基因組DNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，使用Nano Drop測定DNA濃度，將基因組DNA樣品濃度稀釋到50ng/μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 IGS2分析

1.2.2.1 IGS2片段的擴增 使用真菌通用引物5SRNAR/InvSR1R（表2）對供試菌株進行擴增。25μL反應體系：10×PCR buffer 2.5μL（含Mg2+20mmol/L），dNTPs（2.5mmol/L）2μL，引物（10umol/L）0.5μL，模板DNA（50ng/L）0.5μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.25μL，ddH2O補平至25μL。PCR反應條件：94℃3min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1.5min，30個循環(huán)；72℃7min。4℃保存。

1.2.2.2 擴增片段的回收與克隆 PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，利用Axy Prep DNA試劑盒進行回收，按照PGEM-T Vector試劑盒說明書進行連接，轉化于大腸桿菌E.coli DH5α感受態(tài)細胞中，將菌液涂布于含氨芐青霉素的LB平板（含X-gal和IPTG），于37℃倒置培養(yǎng)12～16h，挑取陽性轉化子送往上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.2.3 數(shù)據(jù)分析 對所得序列中計算機誤讀的個別堿基進行人工校對，校對后的DNA序列用NCBI BLAST進行序列搜索，確定為IGS2序列后，使用DNAStar軟件進行序列相似度比對。

表2 IGS2引物Table 2 Primer of IGS2

1.2.3 RAPD分析

1.2.3.1 引物篩選 從隨機引物中篩選出對所有20個菌株擴增效果較好、多態(tài)性高、穩(wěn)定性較強的引物對樣品進行擴增。

1.2.3.2 反應體系及參數(shù) 25μL反應體系：10×PCR buffer 2.5μL（含Mg2+20mmol/L），dNTPs（2.5mmol/L）2μL，引物（10umol/L）0.5μL，模板DNA（50ng/L）2μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.25μL，ddH2O補平至25μL。PCR反應程序為：94℃ 3min；94℃ 1min，38℃ 1min，72℃ 2min，30個循環(huán)；72℃ 7min。4℃保存。PCR產(chǎn)物電泳檢測：PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB染色后，在VDS攝影系統(tǒng)下觀察結果并拍照。

1.2.3.3 數(shù)據(jù)處理 根據(jù)片段的遷移率及有無（有帶記為1，無帶記為0），統(tǒng)計得到二元數(shù)據(jù)，轉換為數(shù)字矩陣。使用NTSYSpc分析軟件對數(shù)據(jù)進行處理，采用UPGMA法構建遺傳相關聚類圖譜。

2 結果與分析

2.1 20株斑玉蕈形態(tài)學特征

選取六株具有代表性的菌株，其子實體形態(tài)圖見圖1。20株斑玉蕈的形態(tài)學特征見表3。

圖1 部分菌株的子實體形態(tài)圖Fig.1 The morphology picture of part strains

2.2 IGS2分析

2.2.1 IGS2-PCR 對20個供試菌株的擴增結果顯示，所有菌株均可擴增出目的片段，不同菌株間IGS2序列大小沒有顯著差異，均在1200bp左右（圖2）。

2.2.2 IGS2-測序 測序結果表明，不同斑玉蕈菌株的IGS2序列大小存在差異，在1150～1203bp之間，將所有菌株的序列提交到GenBank，登錄號見表4。使用DNAStar對序列進行比對和分析并計算序列相似性系數(shù)。20個斑玉蕈菌株的IGS2片段總的變異位點數(shù)為139個，占總堿基數(shù)的11.6%。序列間相似性系數(shù)約在95%以上（表5），除了19號菌株與20號菌株序列完全一致以外，其他菌株序列均存在差異。

表3 20株斑玉蕈形態(tài)學特征Table 3 Morphology character of 20 Hypsizygus marmoreus

圖2 20個斑玉蕈菌株的IGS2擴增電泳圖Fig.2 IGS2-PCR profile of 20 tested strains

表4 斑玉蕈菌株IGS2序列的登錄號Table 4 GenBank accession numbers of IGS2 sequences of 20 strains

表5 20個斑玉蕈菌株IGS2序列相似度Table 5 Table of similarity between sequence

2.3 RAPD分析

2.3.1 RAPD擴增圖譜分析 從供試的100個隨機引物中篩選出條帶清晰穩(wěn)定、多態(tài)性高、重復性好的11個引物（表6）。11個引物共擴增出142條清晰可用的DNA條帶，其中特異性條帶134條，多態(tài)性94.4%。不同引物擴增出的DNA片段數(shù)不盡相同，在8～21條之間，其分子量絕大多數(shù)在0.5～4ku之間，不同菌株的DNA指紋圖譜均包含豐富的多態(tài)信息（圖3）。

表6 RAPD-PCR擴增反應的隨機引物Table 6 Primers of RAPD-PCR

圖3 部分引物對20個斑玉蕈菌株的擴增結果Fig.3 DNA fragments amplified by part random primers

2.3.2 RAPD聚類分析 根據(jù)所得圖譜資料，綜合11個引物對20個菌株的DNA擴增結果，構建遺傳距離矩陣。應用NTSYSpc分析軟件計算菌株間的相似性系數(shù)，用UPGMA法進行聚類分析，生成供試菌株的親緣關系樹狀圖（圖4）。

圖4 RAPD聚類分析圖Fig.4 Dendrogram of 20 strains based on RAPD cluster analysis

根據(jù)圖3顯示的結果，20個斑玉蕈菌株的相似系數(shù)主要在0.57～0.92之間。在大約0.68的相似性水平上，所有的菌株可以分為5個組，第一組以0.77水平值又分成A、B兩個亞組。A組共6個菌株，分別為1、2、4、7、10、11號菌株，B組共5個菌株，分別為3、6、8、15、16號菌株。13和17號菌株歸為第二組，9和1號菌株歸為第三組，14、18、19、20號菌株歸為第四組，其中白色突變菌株（19號）與原野生型菌株（20號）聚為一類，兩個白色野生型菌株（14號和18號）聚為一類。5號菌株與其他所有菌株分開，單獨列為一組。

3 結論與討論

本研究首先對20個供試菌株進行了IGS2序列測序分析，雖然有研究報道IGS2序列為低保守基因區(qū)域，在種內不同菌株間存在明顯差異。但本研究對斑玉蕈不同菌株的測序結果顯示，斑玉蕈的不同菌株間IGS2序列差異不明顯，僅存在個別堿基的差異，大部分菌株的IGS2序列相似度在95%以上，在IGS2片段的瓊脂糖凝膠電泳圖上也不能將不同菌株區(qū)分開來，這與香菇[2]、刺芹側耳[3]、雙色蠟蘑[12]等食用菌IGS2序列的研究結果不一致。在其他部分真菌的IGS研究中，也觀察到與本研究類似的現(xiàn)象，即一個菌株的IGS2序列僅為單一條帶，不存在大小有顯著差異的多態(tài)性條帶。如梁宏等[13]對腥黑粉菌11個菌株的IGS2區(qū)域進行了研究，研究結果表明各菌株的IGS2區(qū)域均為單一條帶，IGS2片段的保守性較強，沒有顯著的差異。在食用菌中，李黎等[14]在研究木耳不同菌株的IGS2序列時發(fā)現(xiàn)，木耳不同菌株的IGS2序列相似度很高，僅存在少數(shù)堿基的差異。因此，不同真菌的IGS2序列存在著明顯的差異，還有待進一步的深入研究。

RAPD是一種能快速、簡便且準確地檢測基因組DNA多態(tài)性的分子標記，本研究通過優(yōu)化RAPDPCR反應體系，使用篩選出的11個引物擴增出了142條DNA條帶，其中多態(tài)性條帶134條，多態(tài)性比例很高，說明RAPD技術可以用于斑玉蕈不同菌株親緣關系的鑒定。根據(jù)RAPD對供試菌株的擴增結果，不同菌株間的擴增圖譜有明顯的差異，因此所選引物可用于斑玉蕈不同菌株的快速鑒定，但由于RAPD技術仍存在不足之處，還需將其進一步轉化為SCAR標記才可以更加準確地對菌株進行鑒定[15]。

通過對遺傳距離及RAPD圖譜的分析，兩個白色野生型菌株單獨聚為一類，表明RAPD技術可以有效地將不同顏色的斑玉蕈菌株區(qū)分。5號菌株與其他所有菌株遺傳距離較遠，單獨聚為一類，這與董巖等的研究結果一致[16]。推測其原因可能是5號菌株從國外引進，與其他來源于國內的斑玉蕈菌株的遺傳背景存在差異，且5號菌株的子實體形態(tài)與其他菌株也存在較大的差異（表2）。白色突變菌株（19號）與原褐色野生型菌株（20號）在RAPD圖譜中聚為一類，且相似系數(shù)為100%，在IGS2測序分析中，兩個菌株的序列相似度同樣為100%，這一結果表明19號菌株確實由20號菌株突變而來。

本研究表明，IGS2分析與RPAD技術相結合的方法準確可靠，其中RAPD技術較IGS2分析具有更加豐富的多態(tài)性，能夠在DNA水平上鑒別不同菌株是否存在差異，為科學、準確地判斷特定菌株的特異性奠定了基礎。

[1]孫培龍，魏紅福，楊開，等.真姬菇研究進展[J].食品科技，2005（9）：54-56.

[2]Saito T，Tanaka N，Shinozawa T.Characterization of subrepeat regions with rDNA intergenic spacers of the edible basidiomycete Lentinula edodes[J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry，2002，66（10）：2125-2133.

[3]黃晨陽，張金霞，鄭素月，等.刺芹側耳rDNA的IGS2多樣性分析[J].農(nóng)業(yè)生物技術學報，2005，13（5）：592-595.

[4]Williams J G K.DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are genetic markers[J].Nucleic Acids Research，1990，18（22）：6531-6535.

[5]徐學鋒，姬宏超，李巧玲，等.草菇有性世代間rDNA序列變異分析及RAPD分析[J].食品工業(yè)科技，2012，33（10）：198-202.

[6]馬銀鵬，陳強，趙夢然，等.中國三省松口蘑遺傳多樣性分析[J].食用菌學報，2012，19（1）：17-21.

[7]Moore A J，Challen M P，Warner P J，et al.RAPD discrimination of Agaricus bisporus mushroom cultivars，Appl Microbiol Biotechnol[J].2001，55：742-749.

[8]Yan P S，Luo X C，Zhou Q.RAPD molecular differentiation of the cultivated strains of the jelly mushrooms，Auricularia auricula and A polytricha[J].World Journal of Microbiology&Biotechnology，2004，20：795-799.

[9]許峰，劉宇，尹永剛，等.北京地區(qū)杏鮑菇菌株遺傳多樣性的RAPD分析[J].中國食用菌，2012，31（6）：35-37.

[10]許占伍，陳輝，馮志勇，等.真姬菇SIEF3136菌株單核體RAPD多態(tài)性分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2010，38（6）：2820-2823.

[11]楊華，李聯(lián)泰.食用菌DNA提取方法研究[J].中國食用菌，2003，22（1）：19-211.

[12]Francis M，Marc-Andre S，F(xiàn)rancois L T.The nuclear rDNA intergenic spacer of the ectomycorrhizal basidiomycete Laccaria bicdor：structural analysis and allelic polymorphism[J].Microbiology，1999，145：1605-1611.

[13]梁宏，彭友良，張國珍，等.腥黑粉菌屬3種檢疫性真菌rDNA-IGS區(qū)的擴增及其序列分析[J].植物病理學報，2006，36（5）：407-412.

[14]李黎.中國木耳栽培種質資源的遺傳多樣性研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學，2011.

[15]Lahgue F，This P，Bouquet A.Identification of a codominant scar marker linked to the seedlessness character in grapevine.Theoretical and Applied Genetics[J].1998，97（5-6）：950-959.

[16]董巖，陳輝，馮志勇，等.真姬菇栽培菌株的ITS和SSR分析[J].上海農(nóng)業(yè)學報，2009，25（3）：59-64.