劉 琴，牛文慧，張薇娜，胡秋輝

(南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院，江蘇省糧油品質(zhì)控制及深加工技術(shù)重點實驗室，江蘇南京210046)

異黃酮(isoflavone)是一種弱的植物雌激素，而大豆是人類獲得異黃酮的主要途徑。已知大豆中的大豆異黃酮共有12種，包括染料木素(genistein，Ge)、大豆素 (daidzein，De)、黃豆黃素 (glycitein，GLe)及其相應(yīng)的糖苷結(jié)合形式、乙?；咸烟擒战Y(jié)合形式和丙二酰基葡萄糖苷結(jié)合形式，均為以3－苯丙吡喃酮為母核的化合物。臨床實驗證明:作為一種主要的植物來源雌激素［1］，大豆異黃酮能有效預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松［2］、更年期綜合癥［3］，具有降血糖［4］、抗高血脂［5］和抑制細菌生長等［6］多種生物活性，此外，它們還具有黃酮類化合物普遍具有的抗氧化作用［7］，能降低慢性非傳染性疾病如心血管?。?］、糖尿?。?］及癌癥(特別是乳腺癌［10］和前列腺癌［11］)的發(fā)病率，因此大豆異黃酮已被用做臨床藥物和保健品。豆芽富含蛋白質(zhì)、纖維素、礦物質(zhì)及維生素，且具有熱量低，爽口等優(yōu)點，是深受中國、韓國、日本等亞洲老百姓的喜愛蔬菜。大豆芽中蛋白質(zhì)、異黃酮等營養(yǎng)和功能性成分與大豆原料差異也引起了人們的研究興趣。于立梅［12］等研究表明，大豆中的蛋白質(zhì)、還原糖、VC和異黃酮含量在發(fā)芽后均較未發(fā)芽時增加。李振艷［13］等也報道了γ－氨基丁酸、大豆異黃酮等功能性因子含量在發(fā)芽過程中都有明顯提高。在有關(guān)大豆發(fā)芽過程中大豆異黃酮含量的變化的報道中，對大豆異黃酮的測定大都是用光度法，即測定的是大豆異黃酮總含量的變化，對于大豆發(fā)芽后異黃酮組成及在豆芽芽莖和子葉中的含量分布的研究還很少。本研究通過液質(zhì)聯(lián)用結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，對大豆芽和大豆原料中異黃酮的總含量和組成進行了比較研究，并對異黃酮在豆芽子葉和芽莖中的分布進行了進一步分析，該研究可為評價大豆芽作為一種餐桌上常見的蔬菜所具有的功能性提供基礎(chǔ)研究的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆原料于2011年10月一次性購于江蘇省蘇果超市，產(chǎn)地東北，屬小粒種大豆(13.90g/百粒種重)。染料木苷標品，色譜純甲醇、醋酸購于Sigma－Aldrich公司;染料木素、大豆苷、大豆素、黃豆黃苷和黃豆黃素標品均購于阿拉丁試劑公司;其他分析純試劑購于中國國藥集團化學試劑有限公司。

FW－100型高速萬能粉碎機 天津市華鑫儀器廠;SHA－B水浴恒溫振蕩器 金壇市榮華儀器制造有限公司;Allegra 64R高速冷凍離心機 美國貝克曼公司;Mill－Q Academic超純水系統(tǒng) 美國 Mill Pore公司;FD－STD冷凍干燥機 美國Labconco公司;Agilent 1100 HPLC/MS(SL)型帶自動進樣器的高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國 Agilent公司;Zorbax SB－C18型反相色譜柱(4.6mm×250mm，5μm) 美國Agilent公司;UV－2900紫外可見分光光度計 日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 豆芽的制作 選取大豆籽粒用清水漂洗后于27℃純水中浸泡8h，然后將大豆單層平鋪托盤中，并用紗布覆蓋，放入27℃左右的人工氣候箱中發(fā)芽。分別收集不同芽長的豆芽測定其中大豆異黃酮總含量。選取芽長為3cm的大豆，將其芽莖與子葉進行分離，分別測定子葉和芽莖中的異黃酮組成［14］。

1.2.2 樣品預(yù)處理 將大豆原料、胚芽和子葉分別用粉碎機預(yù)粉碎，并用石油醚(30～60℃)做溶劑，用索氏抽提法除油后再次粉碎并過80目篩;不同芽長的豆芽，豆芽芽莖和豆芽子葉樣品均經(jīng)冷凍干燥后，再用上述方法除油和粉碎。處理后的樣品置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 大豆異黃酮的提取 準確稱取0.3g上述預(yù)處理后的樣品粉末，按料液比為1∶30(g/mL)，加入70%乙醇進行提取，提取溫度為70℃，提取時間為3.0h。提取液用冷凍離心機離心后取上清液進行大豆異黃酮分析。每個樣品進行3次平行提取，之后的分析取3個平行提取液測定的平均值［15］。

1.2.4 分光光度法測定大豆異黃酮的總含量 以染料木素為標準品，配制不同濃度的染料木素溶液，測定它們在260nm下的吸光度，以濃度(mg/mL)為橫坐標，吸光度值為縱坐標，得到的標準曲線方程為:y=121.58x+0.0184，R2=0.9991。以70%乙醇水溶液為空白，測定不同大豆異黃酮提取液在波長為260nm下的吸光度值，帶入標準曲線方程求出大豆異黃酮總含量，結(jié)果表示為mg(Ge當量)/g(樣品干重)。

1.2.5 大豆異黃酮的組分鑒定 大豆異黃酮提取液中各個組分是根據(jù)液相洗脫過程中流出峰的紫外特征吸收，對應(yīng)的質(zhì)譜峰及其二級質(zhì)譜所得碎片峰進行鑒定的。

液相色譜方法:以含0.1%HAc的水為流動相A，含0.1%HAc的甲醇為流動相 B，控制流速為0.5mL/min，柱溫為35℃，采用 Zorbax SB－C18反相色譜柱(4.6mm ×250mm，5μm)，按照如下梯度洗脫:0～20min，20% ～30%B;20～30min，30% ～35%B;30～40min，35% ～40%B;40～60min，40% ～80%B;60～65min，80% ～20%B;65～70min，20%B。采用DAD檢測器，檢測波長為260nm。

質(zhì)譜條件:霧化氣N230Psi;干燥氣N210 mL/min;毛細管溫度為350℃，在正離子模式下控制毛細管電壓為3.5kV。掃描范圍:m/z 100～2000。二級質(zhì)譜:控制碰撞電壓使母離子的信號強度占峰度最高的子離子強度的20%。

根據(jù)不同大豆異黃酮標品標準曲線，計算不同提取液中各大豆異黃酮組分的含量，結(jié)果換算為mg/100g樣品干重。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 每組實驗均做三組平行，用作實驗分析的數(shù)據(jù)均表示為平均值±標準差。采用統(tǒng)計軟件SAS9.2進行數(shù)據(jù)分析，所有顯著性分析均基于α=0.05的顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆芽在發(fā)芽過程中異黃酮總含量的變化

我們首先用分光光度法對原料和不同芽長的豆芽中的大豆異黃酮總含量進行了分析，結(jié)果見圖1。由圖1可見，大豆發(fā)芽后大豆異黃酮總含量增加了，大豆異黃酮總含量在豆芽芽長3cm時達到最高。對大豆胚芽、大豆子葉、3cm豆芽芽莖和豆芽子葉中異黃酮總含量的比較(表1)表明，大豆胚芽中異黃酮總含量遠高于大豆子葉;豆芽芽莖中的異黃酮總含量也明顯高于豆芽子葉，但低于大豆胚芽中的含量;而豆芽子葉中異黃酮含量略高于大豆子葉。

圖1 原料和不同芽長的豆芽中大豆異黃酮總含量Fig.1 Total isoflavone contents in soybean and germinated soybean in different

2.2 HPLC/MS結(jié)合MS/MS分析大豆及豆芽中異黃酮的組成

為研究大豆發(fā)芽后異黃酮組成的變化，我們首先通過HPLC/MS結(jié)合MS/MS對各樣品的大豆異黃酮提取液進行了分析，圖2為大豆原料、豆芽芽莖和豆芽子葉的大豆異黃酮提取物的液相色譜圖，表2給出了該圖中各色譜峰的保留時間、對應(yīng)的質(zhì)譜、二級質(zhì)譜碎片峰以及根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果給出的對應(yīng)的大豆異黃酮。

表2 大豆異黃酮提取液中主要色譜峰的保留時間、質(zhì)荷比((m/z)、二級質(zhì)譜碎片峰和對應(yīng)的大豆異黃酮種類Table 2 Retention time，m/z value，fragments of MS/MS and corresponding isoflavone compounds of peaks recorded at HPLC chromatogram

表1 大豆和芽長為3cm豆芽中大豆異黃酮的分布比較Table 1 Total isoflavone distribution in soybean and germinated soybean at lenghth of 3 cm

在液相色譜中共檢測到16個主要峰，11種異黃酮，其中9個為已知的大豆異黃酮成分，兩個為未知組分(峰4和峰6)，兩個未知組分的最大吸收波長均為260nm，峰4的串聯(lián)質(zhì)譜的碎片峰的基峰為255.0，對應(yīng)于大豆素的正離子的m/z值，應(yīng)屬于大豆素類異黃酮，峰9串聯(lián)質(zhì)譜的基峰為271.1，對應(yīng)于染料木素的m/z值，應(yīng)屬于染料木素類異黃酮，這兩個化合物需進一步鑒定。此外，這兩個組分只在豆芽芽莖中檢測到，在大豆原料和豆芽子葉中均未檢出。而乙酰基類大豆異黃酮未能在我們的樣品中檢出。

2.3 大豆及豆芽中各大豆異黃酮組分的含量及其分布

2.3.1 大豆異黃酮的標準曲線 按1.2.5中的色譜條件進樣，以峰面積為縱坐標(Y)，標準品濃度(mg/mL)為橫坐標(X)，分別得到染料木素、大豆素、黃豆黃素、大豆苷、染料木苷、黃豆黃苷的標準曲線方程如表3所示。

圖2 大豆原料(a)，3cm豆芽芽莖(b)及3cm豆芽子葉(c)的大豆異黃酮提取液的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of the isoflavone extractions from(a)soybean，(b)sprout and(c)cotyledon from germinated soybean respectively

表4 大豆原料及3cm豆芽中各大豆異黃酮組分的含量及在原料胚芽、子葉及豆芽芽莖和子葉中的分布Table 4 Content of isoflavone in different samples

表3 各標準品的標準曲線Table 3 Standard curves of isoflavone standards

2.3.2 大豆及豆芽中各大豆異黃酮組分的含量及其分布 為比較大豆發(fā)芽前后各異黃酮含量及分布的變化，我們分別以染料木素、大豆素、黃豆黃素、大豆苷、染料木苷、黃豆黃苷對大豆原料，大豆胚芽、大豆子葉、3cm豆芽芽莖、3cm豆芽子葉中的各大豆異黃酮組分的含量進行了分析，其中丙二?；玖夏拒?、丙二?；蠖管辗謩e以染料木苷和大豆苷為標品進行定量分析，結(jié)果見表4。由表4可以看到，與光度分析結(jié)果一致，大豆籽粒的胚芽中各大豆異黃酮組分含量及總含量均遠高于大豆子葉，其中大豆胚芽中的大豆異黃酮總含量為大豆子葉中的11倍左右，與Kim［16］等人的研究相符，其中大豆苷(D)、丙二酰基大豆苷(MD)含量分別為子葉中含量的12和17倍以上;黃豆黃苷(GL)、丙二?；S豆黃苷(MGL)含量分別為子葉中的32倍和53倍;染料木素(Ge)和大豆素(De)在胚芽中的含量分別為子葉中的12倍和14倍左右。黃豆黃素(Gle)在胚芽中含量遠高于染料木素的含量，但在大豆子葉中未能檢測到。

在豆芽中，豆芽芽莖中染料木苷(G)含量與豆芽子葉相近，丙二?；玖夏拒?MG)含量低于豆芽子葉外，其余各組分含量均顯著高于豆芽子葉中的含量，其中大豆苷(D)和丙二?；蠖管?MD)的含量分別為豆芽子葉中的5倍和4倍左右;黃豆黃苷(GL)、丙二?；S豆黃苷(MGL)和黃豆黃素(GLe)在豆芽子葉中均未能檢出，但在豆芽芽莖中的含量分別為86.94、132.16和14.05 mg/100g，高于染料木苷(G)、丙二?；玖夏拒?MG)和染料木素(Ge)的含量。豆芽子葉中各大豆異黃酮組分含量及總含量均高于大豆子葉，而豆芽芽莖中除大豆素(De)和黃豆黃素(GLe)外，其余各組分含量均顯著低于大豆胚芽中的含量。

在大豆胚芽和豆芽芽莖中，丙二酰基大豆苷的含量最高，在大豆胚芽中占大豆異黃酮總含量的46.79%，而在豆芽芽莖中占38.2%;在大豆子葉和豆芽子葉中丙二酰基染料木苷的含量最高，分別占大豆異黃酮總含量的40.97% 和45.51%。在所有樣品中，丙二酰基葡萄糖苷類異黃酮含量均高于相應(yīng)的糖苷類，而苷元的含量最低。

圖3 不同樣品中各大豆異黃酮類別的干重百分含量Fig.3 Dry percentage of different isoflavones class in different samples

3 結(jié)論

對不同芽長的大豆芽中大豆異黃酮含量研究表明，大豆發(fā)芽后異黃酮總含量逐漸增加，在芽長為3cm時達到最高，其中芽莖中大豆異黃酮的總含量達到子葉的4倍以上，為大豆原料的2倍以上。由圖3可以看出，大豆和大豆芽不同部位的大豆異黃酮組成存在顯著差異，在大豆胚芽和豆芽芽莖中，大豆苷類(D+MD)異黃酮含量最高，其次是黃豆黃苷類(GL+MGL)，染料木苷類大豆異黃酮(G+MG)含量次之，苷元類(De+Ge+Gle)含量最低。在大豆、大豆子葉和豆芽子葉中則是染料木苷類大豆異黃酮(G+MG)含量最高，其次是大豆苷類(D+MD)。有研究表明［17］，在代謝過程中，大豆苷類異黃酮的生物可利用率高于染料木苷和黃豆黃苷類異黃酮，而異黃酮苷元的生物可利用度高于異黃酮糖苷和丙二?；咸烟擒疹惍慄S酮，我們的研究結(jié)果表明，豆芽芽莖中大豆異黃酮總含量，大豆苷類和苷元類異黃酮的含量顯著高于大豆原料和豆芽子葉，因此相比較大豆本身，大豆芽芽莖可能是一種好的大豆異黃酮的食品來源。

［1］侯建峰.植物雌激素干預(yù)乳腺癌的研究進展［J］.臨床腫瘤學雜志，2010，15(1):82－85.

［2］Yukihiro I，Masayuki I，Akemi M，et al.Intake of fermented soybeans，natto，is associated with reduced bone loss in postmenopausal women:Japanese population－based osteoporosis(JPOS)study［J］.Journal of Nutrition，2006，136:1323－1328.

［3］金慶躍，宋愛清，毛唯葉，等.大豆異黃酮對不同雌激素受體基因型絕經(jīng)后婦女骨代謝的影響［J］.中國老年學雜志，2011，31(2):503－504.

［4］韓小存，丁長河.大豆膳食纖維和大豆異黃酮對糖尿病影響［J］.糧食與油脂，2012，6:7－9.

［5］逄曉云，沈金芳，貢沁燕，等.大豆異黃酮對大鼠血脂的影響及其體內(nèi)外抗氧化作用研究［J］.中國臨床藥理學與治療學，2008，13(1):62－67.

［6］吳偉，王儲炎，吳傳華，等.大豆異黃酮的研究概況［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工，2008，3(3):33－36.

［7］Hagen M K，Ludke A，Araujo A S，et al.Antioxidant characterization of soy derived products in vitro and the effect of a soy diet on peripheral markers of oxidative stress in a heart disease model［J］.Canadian Journal of Physiology and Pharmacology，2012，90(8):1095－1103.

［8］Adams M R，Golden D L，William s J K.Soy Protein containing isoflavones reduces the size of atherosclerotic plaques without affecting coronary artery reactivity in adult male monkeys［J］.Journal of Nutrition，2005，135:2852－2856.

［9］廖葦萍，石元剛.黃芪多糖和大豆異黃酮對糖尿病大鼠糖代謝的影響［J］.第三軍醫(yī)大學學報，2007，29(5):416－418.

［10］Anna H W，Mimi C Y，Chui C T，et al.Plasma isoflavone levels versus self－reported soy isoflavone levels in Asian－American women in Los Angeles County［J］.Carcinogenesis，2004，25(1):77－81.

［11］Chris H T，Kira G，Xiao H，et al.Phase I pharmacokinetic and pharmacodynamic analysis of unconjugated soy isoflavones administered to individuals with cancer［J］.Cancer Epidemiology，2003，12:1213－1220.

［12］于立梅，鐘惠曾，于新，等.大豆發(fā)芽過程中營養(yǎng)成分變化規(guī)律的研究［J］.中國糧油學報，2010，25(8):19－22.

［13］李振艷，張永忠，任紅波.大豆發(fā)芽過程在異黃酮、γ－氨基丁酸等成分含量變化的研究［J］.食品工業(yè)科技，2009，30(12):356－361.

［14］Luz M P，Mark A B，José Marcos G M.Effect of time and temperature on bioactive compounds in germinated Brazilian soybean cultivar BRS 258［J］.Journal of Food Research International，2010，43:1856－1865.

［15］Guajardo－Flores D，García－Pati?o M，Serna－Guerrero D.Characterization and quantification of saponins and flavonoids in sprouts，seed coats and cotyledons of germinated black beans［J］.Journal of Food Chemistry，2012，134:1312－1319.

［16］Kim J A，Hong S B，Jung W S，et al.Comparison of isoflavones composition in seed，embroyo，cotyledon and seed coat of cooked－with－rice and vegetable soybean(Glycine max L.)varieties［J］.Food Chemistry，2007，102:738－744.

［17］陳寶江，崔揚健.大豆異黃酮作用機制及在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用［J］.動物科學與動物醫(yī)學，2003，20(10):53－55.