高雅慧，金則成，錢 超，李子杰，* ，中西秀樹，高曉冬

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122;2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122)

稀有糖是近年來國際上研究功能性甜味劑的一個(gè)熱點(diǎn)，其定義為在自然界中存在但含量很低的單糖及其衍生物［1］。由于稀有糖在食用后產(chǎn)生能量較少且具有獨(dú)特的功能和潛在的醫(yī)療價(jià)值，受到廣泛關(guān)注［2－5］。在有機(jī)合成領(lǐng)域，醛縮酶催化的羥醛縮合反應(yīng)已成為C－C鍵不對稱合成必不可少的工具之一［6－8］。 磷 酸 二 羥 基 丙 酮 (dihydroxyacetone phosphate，DHAP)依賴型醛縮酶催化生成的產(chǎn)物具有兩個(gè)新的立體中心［9］，其構(gòu)型一般由醛縮酶決定，而不依賴于底物的結(jié)構(gòu)或立體化學(xué)［10］。雖然利用該組酶類成功合成了許多常規(guī)化學(xué)法難以合成的糖類化合物［8－11］，然而專門用來合成稀有糖的研究還比較少。DHAP依賴型醛縮酶可接受多種醛作為受體，但對供體DHAP專一性很高［12］。由于DHAP價(jià)格昂貴且不穩(wěn)定，限制了該酶類實(shí)際合成應(yīng)用［12－14］。為避免使用昂貴且不穩(wěn)定的底物DHAP，F(xiàn)essner等首次建立了“一鍋四酶法”［15］。作者前期結(jié)果表明 L－1－磷酸鼠李樹膠糖醛縮酶(L－rhamnulose 1－phosphate aldolase，RhaD)可以接受D－甘油醛作為受體，但失去了對D－甘油醛的立體選擇性，同時(shí)生成了兩種稀有糖 D－山梨糖和 D－阿洛酮糖［16］(圖1)。

圖1 利用RhaD酶法合成D－山梨糖和D－阿洛酮糖Fig.1 Enzymatic synthesis of D－sorbose and D－psicose with RhaD

在本研究中，為了降低反應(yīng)成本，以更為便宜的底物DL－3－磷酸甘油代替L－3－磷酸甘油作為前體，采用“一鍋四酶法”的方法對D－山梨糖和D－阿洛酮糖的合成進(jìn)行了優(yōu)化(圖2)。在羥醛縮合反應(yīng)中，酸性磷酸酶(acid phosphatase，AP)常用來脫掉縮合產(chǎn)物的磷酸基團(tuán)得到目的產(chǎn)物，此外磷酸酶YqaB在中性pH下對多種磷酸糖具有較強(qiáng)的磷酸酶活性［17］。探索在“一鍋四酶法”中用YqaB取代AP，可以減少酸堿及含鹽廢液的排放，代表了綠色食品的方向。

圖2 利用RhaD合成D－山梨糖和D－阿洛酮糖Fig.2 Synthesis of D－sorbose and D－psicose based on RhaD

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株 由實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏的基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28a－ rhaD，E.coliBL21(DE3)/pET28a－yqaB 用來表達(dá) RhaD 醛縮酶［16］和YqaB 磷酸酶［18］;DL－3－磷酸甘油、D－甘油醛、磷酸甘油氧化酶(glycerol phosphate oxidase，GPO)、過氧化氫酶、酸性磷酸酶、D－山梨糖(D－sorbose)、D－阿洛酮糖(D－psicose)、茴香醛、Ca2+離子交換樹脂Sigma－Aldrich;薄層色譜 (ThinLayer Chromatography，TLC)、硅膠鋁板 60 F254、硅膠 60(200～400目) EMD Chemicals;Bio gel P－2膠、Aminex HPX－87H column(300mm ×7.8mm)Bio－Rad Laboratories;Pierce BCA蛋白濃度測定試劑盒及其他化學(xué)試劑 Thermo Scientific。

高效液相色譜儀 配有示差檢測器，日本島津公司;AKTAFPLC蛋白純化系統(tǒng) 美國GE Healthcare公司;IS－971R型全溫振蕩培養(yǎng)箱 韓國Lab Companion公司;Eppendorf－5415D離心機(jī) 德國Eppendorf公司;J2－21型離心機(jī) 美國Beckman公司;Buchi旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、恒溫水浴鍋 美國Fisher Scientific公司;真空冷凍干燥機(jī) 美國Labconco公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 RhaD醛縮酶和YqaB磷酸酶的表達(dá)和純化參照前期的工作［16，18］的方法。

1.2.2 D－阿洛酮糖和D－山梨糖的合成 以DL－3－磷酸甘油為前體“一鍋四酶法”合成D－阿洛酮糖和D－山梨糖。

反應(yīng)體系(10mL):DL－3－磷酸甘油(548.78mg，2.4mmol)，D－甘油醛(0.5mol/L 2mL，1mmol)，GPO(70U，2mg)，過氧化氫酶(1000U，1.18μL)，RhaD(272μL，終濃度0.5mg/mL)，補(bǔ)加無菌水使反應(yīng)總體積為10mL。反應(yīng)液在室溫下輕搖反應(yīng)16～22h，反應(yīng)通過TLC來檢測(展開劑為正丁醇∶乙酸∶水 =2∶1∶1(v∶v∶v))。反應(yīng)終了后，向反應(yīng)液中加入6mol/L HCl調(diào)pH為4.6，然后加入2μL AP(3U)，在37℃輕搖反應(yīng)20～24h，用TLC來監(jiān)測反應(yīng)(展開劑為正丁醇∶乙酸∶水 =2∶1∶1(v∶v∶v)或乙酸乙酯∶異丙醇∶水 =9∶3∶1(v∶v∶v))。反應(yīng)完全后，用1mol/L NaOH 將 pH 調(diào)整到7.0。為了避免使用酸和堿，當(dāng)以YqaB代替AP脫磷酸基團(tuán)時(shí)，無需調(diào)pH直接向反應(yīng)液中加入YqaB(終濃度為0.25mg/mL)和MgCl2(終濃度為2.5mmol/L)，反應(yīng)液在37℃，150r/min反應(yīng)約12h。

1.2.3 D－山梨糖和D－阿洛酮糖的分離純化參照文獻(xiàn)［16］。

1.2.3.1 硅膠純化 樣品的前處理:向反應(yīng)液中加入適量甲醇并離心除掉變性蛋白，將上清液轉(zhuǎn)入到100mL的圓底燒瓶，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上30℃下減壓濃縮樣品。當(dāng)樣品濃縮至5mL體積時(shí)，加入適量的硅膠，使上清液全部吸附到硅膠粉上并成粉末狀后，結(jié)束旋蒸。裝硅膠柱:將一根1.5cm×25cm玻璃柱子垂直固定于鐵架臺上。將1g硅膠粉加入約100mL的乙酸乙酯中，混勻后，一次性倒入柱子中，加壓，使乙酸乙酯液面距離硅膠面約4cm。上樣、純化及濃縮:將吸附有樣品的硅膠粉末小心地加入到硅膠柱，先用乙酸乙酯為流動相，去除一些非極性小分子，然后用流動相乙酸乙酯∶異丙醇∶水=9∶3∶1(體積比)進(jìn)行洗脫并依次收集于試管中。按照先后順序用毛細(xì)管吸取洗脫液，依次滴到硅膠鋁板上，吹干，顯色，先初步判定哪些試管中的洗脫液含有目的產(chǎn)物。然后再以D－山梨糖，D－阿洛酮糖為標(biāo)準(zhǔn)物，以乙酸乙酯∶異丙醇∶水=9∶3∶1(體積比)為展開劑，重新做TLC以進(jìn)一步確定哪些洗脫液中含有目的產(chǎn)物。將含有目的產(chǎn)物的洗脫液合并，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1～2mL。

1.2.3.2 P－2凝膠排阻層析純化 P－2填料的前處理與裝柱:將一根1.5cm×90cm玻璃柱子垂直固定于鐵架臺上，加入脫氣后的去離子水至高度約20cm關(guān)閉出水口。按照P－2凝膠的說明對填料進(jìn)行預(yù)處理后，輕輕地混勻，先倒入適量的填料到柱子，使其沉積一定的高度后，打開出水口，并不斷地加入填料，當(dāng)膠面至合適高度時(shí)，用脫氣后的去離子水平衡柱子過夜。上樣與分離:關(guān)閉入水口，打開出水口，當(dāng)液面降至膠面處時(shí)關(guān)閉出水口。將濃縮液(不超過2mL)小心均勻地加入到膠面上，當(dāng)濃縮液完全進(jìn)入到膠面內(nèi)時(shí)，向柱床上方加入10mL去離子水并連通入水口，開始分離，并用自動收集器進(jìn)行收集。用毛細(xì)管按順序依次點(diǎn)樣，吹干，顯色，初步確定哪些試管中的收集液含有目的產(chǎn)物，然后以標(biāo)準(zhǔn)品為對照，重新做TLC和HPLC進(jìn)行確定。將含有目的產(chǎn)物的洗脫液合并，用真空冷凍干燥機(jī)凍干，稱重。

1.2.3.3 Ca2+離子交換樹脂純化 離子交換樹脂的前處理:樹脂用超純水浸泡30min后，傾倒以除去一些懸浮物，重復(fù)兩次。最后樹脂用超純水浸泡，輕輕混勻。裝柱及分離:將帶有夾套的玻璃柱子(26mm×100mm)垂直固定在鐵架臺上，關(guān)閉出水口，向柱子加入高度約20cm的超純水，倒入混勻的樹脂，待樹脂沉積到高度約10cm，打開出水口并不斷的加入樹脂，待樹脂高度距柱子的最上端約5cm時(shí)，裝柱完成，打開超純水的入水口，平衡柱子2h。將水浴鍋加熱，使水溫為70℃，通過蠕動泵將水輸入到夾套里，夾套的出水口通過管路重新流到水浴鍋里，平衡30min后，準(zhǔn)備上樣。將凍干后的樣品D－阿洛酮糖和D－山梨糖的混合物用5mL的去離子水溶解，均勻地加到膠面上，待樣品液全部進(jìn)入到柱床后，向膠面加入20mL去離子水后，打開入水口，開始分離純化，流速約1.5mL/min，使用自動收集器進(jìn)行收集。用毛細(xì)管按順序依次點(diǎn)樣，吹干，顯色，初步確定哪些試管中的收集液含有目的產(chǎn)物，然后以標(biāo)準(zhǔn)品為對照，用TLC和HPLC進(jìn)行確定，將含有D－山梨糖和D－阿洛酮糖的洗脫液分別合并，用真空冷凍干燥機(jī)凍干，稱重，1H NMR鑒定。

1.2.4 TLC顯色劑配制方法 18mL茴香醛溶于540mL 95%乙醇中，混勻置于冰水混合物上。將30mL 97%的硫酸與6mL乙酸混合得到混合酸，然后小心地將混和酸液逐滴加入到預(yù)冷的茴香醛乙醇溶液中并劇烈振蕩，將得到的無色溶液－20℃保存。

1.2.5 HPLC流動相的配制及反應(yīng)液中D－山梨糖和D－阿洛酮糖比例的測定 272μL H2SO4加到含有1L去離子水(18.2MΩ·cm)的2L燒杯中，混勻。將裝配好的抽濾瓶連接到真空水泵，將流動相過濾脫氣，得到濃度為5mmol/L的流動相。利用色譜柱HPX－87H(300mm×7.8mm，氫型陽離子交換樹脂，填料為聚苯乙烯二乙烯苯樹脂)來測定終反應(yīng)液中D－山梨糖和D－阿洛酮糖的比例。吸取反應(yīng)液100μL離心，上清液用HPLC進(jìn)行檢測。HPLC工作條件:5mmol/L H2SO4作為流動相，流速0.5mL/min，柱溫箱溫度60℃，示差檢測器進(jìn)行檢測。采用相同的HPLC工作條件進(jìn)行D－山梨糖和D－阿洛酮糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 TLC檢測以DL－3－磷酸甘油為前體的“一鍋四酶法”反應(yīng)

當(dāng)反應(yīng)體系未加AP，以DL－3－磷酸甘油為底物，產(chǎn)物1－磷酸酮糖的生成的TLC分析如圖3－a所示，經(jīng)過正丁醇∶乙酸∶水 =2∶1∶1(v/v/v)展開劑展層、茴香醛染液染色，能夠檢測到1－磷酸酮糖的生成并在TLC板上顯示深靛藍(lán)色;向反應(yīng)體系中加入AP進(jìn)行脫磷酸化反應(yīng)后產(chǎn)物D－山梨糖和D－阿洛酮糖的生成如圖3－b和圖3－c所示。當(dāng)用正丁醇∶乙酸∶水=2∶1∶1(v/v/v)展開劑展層以及茴香醛染液染色后，同未加入AP相比，反應(yīng)液加入AP后，在D－山梨糖和D－阿洛酮糖的位置有新點(diǎn)生成，但D－山梨糖和D－阿洛酮糖的Rf值很接近，在該展層劑下很難將兩者分開(圖3－b);為了較好地將D－山梨糖和D－阿洛酮糖分離開來，使用展開劑乙酸乙酯∶異丙醇∶水=9∶3∶1(v/v/v)進(jìn)行展層，經(jīng)過茴香醛染液染色可以看到該展層劑可以很好地將D－山梨糖和D－阿洛酮糖分離開來并且反應(yīng)液在D－山梨糖和D－阿洛酮糖的位置上有新點(diǎn)生成(圖3－c)。

圖3 TLC分析D－山梨糖和D－阿洛酮糖Fig.3 TLC analysis of D－sorbose and D－psicose

2.2 D－山梨糖和D－阿洛酮糖的HPLC檢測及比例測定

為了進(jìn)一步確定得到的產(chǎn)物為D－山梨糖和D－阿洛酮糖，反應(yīng)液用HPLC進(jìn)行檢測，并用D－山梨糖和D－阿洛酮糖標(biāo)準(zhǔn)品作為對照。通過HPLC可以看出反應(yīng)液在標(biāo)準(zhǔn)品D－山梨糖和D－阿洛酮糖的出峰位置都可以檢測到相應(yīng)的產(chǎn)物(圖4)。為了計(jì)算這兩種稀有糖的比例，配制不同濃度的D－山梨糖和D－阿洛酮糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，采用相同的HPLC檢測條件，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測得D－山梨糖/D阿洛酮糖比例約為1.2∶1。

2.3 D－山梨糖和D－阿洛酮糖的分離純化

圖4 HPLC分析D－山梨糖和D－阿洛酮糖Fig.4 HPLC analysis of D－sorbose and D－psicose

將上述反應(yīng)液經(jīng)硅膠和P－2凝膠過濾純化，兩種單糖總的產(chǎn)率為39%(由于DL－3－磷酸甘油中所含有的L－3－磷酸甘油(1.2mmol)相對于D－甘油醛(1.0mmol)是過量的，轉(zhuǎn)化率按照D－甘油醛的量來計(jì)算)。D－山梨糖和D－阿洛酮糖混合物可以通過Ca2+離子交換樹脂進(jìn)行分離，典型的分離曲線如圖5所示［16］。經(jīng)過Ca2+離子交換樹脂進(jìn)行進(jìn)一步分離，分別得到純的D－山梨糖和D－阿洛酮糖。

圖5 D－山梨糖和D－阿洛酮糖的分離曲線Fig.5 Separation profile of D－sorbose and D－psicose with cation exchange resin

2.4 YqaB磷酸酶取代AP用于D－山梨糖和D－阿洛酮糖的合成

為了驗(yàn)證YqaB磷酸酶在“一鍋四酶法”合成中的應(yīng)用，反應(yīng)液用HPLC進(jìn)行檢測，并以D－山梨糖和D－阿洛酮糖標(biāo)準(zhǔn)品作為對照。通過HPLC可以看出反應(yīng)液在標(biāo)準(zhǔn)品D－山梨糖和D－阿洛酮糖的出峰位置都可以檢測到相應(yīng)的產(chǎn)物(圖6)，從而表明YqaB可以實(shí)現(xiàn)脫磷酸化得到D－山梨糖和D－阿洛酮糖，并通過相同的方法測得D－山梨糖/D－阿洛酮糖的比例約為2∶3。通過硅膠純化、P－2凝膠過濾層析，得到D－山梨糖和D－阿洛酮糖這兩種單糖的混合物。由于在反應(yīng)體系中，DL－3－磷酸甘油中L－3－磷酸甘油的量相對于D－甘油醛是過量的，根據(jù)D－甘油醛的量計(jì)算得到這兩種單糖總的產(chǎn)率為36%。D－山梨糖和D－阿洛酮糖的混合物經(jīng)過Ca2+離子交換樹脂純化，分別得到純的D－山梨糖和D－阿洛酮糖。

2.5 純化后的D－山梨糖和D－阿洛酮糖的1H NMR鑒定

為了鑒定經(jīng)過Ca2+交換樹脂分離得到的產(chǎn)物分別為D－山梨糖和D－阿洛酮糖，以D－山梨糖和D－阿洛酮糖的標(biāo)準(zhǔn)品作為對照，對產(chǎn)物進(jìn)行1H NMR測定。由NMR比對結(jié)果可知，經(jīng)過分離純化后得到的產(chǎn)物為D－山梨糖和D－阿洛酮糖(圖7)。

圖6 HPLC分析D－山梨糖和D－阿洛酮糖Fig.6 HPLC analysis of D－sorbose and D－psicose

圖7 純化后的產(chǎn)物D－山梨糖和D－阿洛酮糖的1H NMR鑒定Fig.7 Characterization of the products D－sorbose and D－psicose after purification by1H NMR

3 結(jié)論

本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，為避免在羥醛縮合反應(yīng)中直接使用昂貴且不穩(wěn)定的底物DHAP，以便宜的底物DL－3－磷酸甘油作為前體物質(zhì)，采用“一鍋四酶法”的方法對D－山梨糖和D－阿洛酮糖的合成進(jìn)行了優(yōu)化，從而降低了反應(yīng)成本。屬于鹵酸脫鹵酶超家族的非專一性磷酸酶YqaB在中性pH下對多種磷酸糖具有較強(qiáng)的磷酸酶活性。為了避免在稀有糖的合成中使用酸和堿，以YqaB取代AP進(jìn)行了D－山梨糖和D－阿洛酮糖的合成。本研究所采用的方法適用于其他DHAP依賴型醛縮酶，相信該方法的建立將為稀有糖及其衍生物的大量合成提供理論依據(jù)。

［1］Oh D K，Kim N H，Kim H J，et al.D－Psicose production from D－fructose using an isolated strain Sinorhizobium sp［J］.World J Microbiol Biotechnol，2007，23(4):559－563.

［2］Poonperm W，Takata G，Ando Y，et al.Efficient conversion of allitol to D－psicose by Bacillus pallidus Y25［J］.J Biosci Bioeng，2007，103(3):282－285.

［3］ Hossain A，Yamaguchi F，Matsunaga T，et al.Rare sguar D－psicose protects pancreas β－islets and thus improves insulin resistance in OLETF rats［J］.Biochem Bioph Res Co，2012，425(4):717－723.

［4］Rhimi M，Chouayekh H，Gouillouard I，et al.Production of D－tagatose，a low caloric sweetener during milk fermentation using l－arabinose isomerase ［J］.Bioresource Technol，2011，102(3):3309－3315.

［5］ Ishihara Y，Katayama K，Sakabe M，et al.Antioxidant properties of rare sugar D－allose:Effects on mitochondrial reactive oxygen species production in Neuro2A cells［J］.J Biosci Bioeng，2011，112(6):638－42.

［6］Samland A K，Sprenger G A.Microbial aldolases as C－C bonding enzymes－－ unknown treasures and new developments［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2006，71(3):253－264.

［7］Castillo J A，Calveras J，Casas J，et al.Fructose－6－phosphate aldolase in organic synthesis:preparation of D－fagomine，N－alkylated derivatives，and preliminary biological assays［J］.Org Lett，2006，8(26):6067－6070.

［8］ Iturrate L，Sanchez M I，Oroz G I，et al.Preparation and characterization of a bifunctional aldolase/kinase enzyme:a more efficient biocatalyst for C－C bond formation［J］.Chemistry，2010，16(13):4018－4030.

［9］Machajewski T D，Wong C H.The catalytic asymmetric aldol reaction［J］.Angew Chem Int Ed，2000，39(8):1352－1375.

［10］Clapes P，F(xiàn)essner W D，Sprenger G A，et al.Recent progress in stereoselective synthesis with aldolases［J］.Curr Opin Chem Biol，2010，14(2):154－167.

［11］Babich L，Hartog A F，van Hemert L J C，et al.Synthesis of carbohydrates in a continuous flow reactorby immobilized phosphatase and aldolase［J］.Chem Sus Chem，2012，5(12):2348－2353.

［12］Sugiyama M，Hong Z，Greenberg W A，et al.In vivo selection for the directed evolution of L－rhamnulose aldolase from L－rhamnulose－1－ phosphate aldolase(RhaD)［J］.Bioorg Med Chem，2007，15(17):5905－5911.

［13］ BreuerM，HauerB.Carbon－carbon coupling in biotransformation［J］.Curr Opin Biotechnol，2003，14(6):570－576.

［14］Israel S M，Juan F G，Agatha B，et al.Multienzyme system for dihydroxyacetone phosphate－dependent aldolase catalyzed C－C bond formation from dihydroxyacetone［J］.Chem Commun，2004(14):1634－1635.

［15］ Fessner W D，Sinerius G.Synthesis of Dihydroxyacetone phosphate(and isosteric analogues)by enzymatic oxidation;sugar from glycerol［J］.Angew Chem Int Ed Engl，1994，33(2):209－212.

［16］Li Z，Cai L，Qi Q，et al.Enzymatic synthesis of D－sorbose and D－psicose with aldolase RhaD:Effectofacceptor configuration on enzyme stereoselectivity［J］.Bioorg Med Chem Lett，2011，21(23):7081－7084.

［17］Kuznetsova E，Proudfoot M，Gonzalez C F，et al.Genomewide analysis of substrate specificities of the Escherichia coli haloacid dehalogenase－like phosphatase family［J］.J Biol Chem，2006，281(47):36149－36161.

［18］ Li Z，Cai L，Qi Q，et al.Synthesis of Rare Sugars with L－fuculose－ 1 － phosphatealdolase(FucA)from Thermus thermophilus HB8［J］.Bioorg Med Chem Lett，2011，21(17):5084－5087.